[发明专利]一种液质联用测定人血浆中内源性雌二醇浓度的方法

权利要求书

1.一种液质联用测定人血浆中内源性雌二醇浓度的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)替代基质的选择：选择1％BSA水溶液溶液作为替代基质进行人血浆中雌二醇的方法学验证试验及样品分析试验；

(2)人血浆中内源性雌二醇浓度的确定：用步骤(1)所述的替代基质进行标准曲线样品的配制，然后对人血浆中的本底雌二醇的浓度进行测定，确定混合后的人血浆中雌二醇的平均浓度用以计算实际质控样品的理论浓度；

(3)标准曲线样品的制备及前处理：包括内标工作液的配制、标准系列溶液的配制、工作曲线样品的前处理，其中，

内标工作液的配制为取17β-Estradiol-d4标准品经质量校正因子校正后，加适量甲醇溶解，即得浓度为1.00mg/mL的储备液，再用50％的甲醇水溶液稀释成为25.0ng/mL的内标工作液；

标准系列溶液的配制为取雌二醇标准品，经质量校正因子校正后，加适量甲醇溶解，得到浓度为1.00mg/mL的储备液，再用50％的甲醇水溶液稀释成为0.500、1.00、3.00、20.0、100、400、800和1000ng/mL的系列标准曲线工作液；

工作曲线样品的前处理为向475μL的1％BSA水溶液中分别加入25.0μL的上述系列标准曲线工作液，配制成相当于雌二醇在替代基质中的浓度为0.0250、0.0500、0.150、1.00、5.00、20.0、40.0和50.0ng/mL的样品，分装出2份，每份150μL；每份加入20.0μL的内标工作液，再加入600μL乙酸乙酯:正己烷＝2:1(v/v)的萃取剂进行萃取，离心后取400μL上清液，40℃氮气流下吹干，加入100μL的50％甲醇水溶液复溶剂，震荡离心后，供LC-MS/MS测定；

(4)质控样品的制备及前处理：包括标准系列溶液配制、质控样品的前处理，其中，

标准系列溶液的配制为取雌二醇标准品，经质量校正因子校正后，加适量甲醇溶解，即得浓度为1.00mg/mL的储备液，再用50％甲醇水溶液稀释成为760ng/mL的高浓度质控工作液和30.0ng/mL中浓度质控工作液的质控工作液；

质控样品的前处理为向950μL人血浆中加入50.0μL中浓度质控工作液和高浓度质控工作液，配制相当于雌二醇在血浆基质中1.57ng/mL的中浓度质控样品和38.1ng/mL的高浓度质控样品；取一定体积人空白血浆，再用替代基质稀释，配制0.075ng/ml的低浓度质控样品及0.0250ng/mL的定量下限质控样品，每个质控样品分装出6份，每份150μL，向每份质控样品中加入20.0μL的内标工作液，再加入600μL的乙酸乙酯:正己烷＝2:1(v/v)的萃取剂进行萃取，离心后取400μL上清液，40℃氮气流下吹干，加入100μL 50％甲醇水溶液复溶剂，震荡离心后，供LC-MS/MS测定；

(5)采用内标法定量，以系列雌二醇在替代基质中的浓度为横坐标，雌二醇与内标的峰面积比为纵坐标，进行线性回归运算，权重因子为1/x²，得到线性回归方程，即为工作曲线，使用工作曲线，对人血浆中内源性雌二醇的浓度进行测定。

2.根据权利要求1所述的一种液质联用测定人血浆中内源性雌二醇浓度的方法，其特征在于，所述LC-MS/MS测定条件包括：

液相色谱条件：

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH Phenyl 1.7μm 2.1×50mm，Waters；

流动相：A为含0.1％氨水的水溶液；B为含0.1％氨水的甲醇:乙腈:水＝475:475:50(v/v/v)的溶液溶液，

梯度如下：

0-0.30min，流动相A为60.0％，流动相B为40.0％；0.30-1.80min，流动相A从60.0％到0，流动相B从40.0％到100％；1.80-2.30min，流动相B保持为100％；2.30-2.40min，流动相A从0到60.0％，流动相B从100％到40.0％；2.40-3.00min，流动相A为60.0％，流动相B为40.0％；

流速：0.400mL/min，柱温：40℃，进样量：10.0μL；

质谱检测器及条件：离子源为电喷雾离子源；喷雾电压为-4500V；离子源温度：650℃；帘气：25psi，

碰撞气：9psi，GS1：50psi，GS2：50psi；负离子方式检测；扫描方式：MRM；雌二醇定量离子对为271.2→145.0，碰撞电压为-52.0eV；内标17β-Estradiol-d4定量离子对为275.2→147.0，碰撞电压为-52.0eV。