[发明专利]一种橘色双冠丽鱼黑色素细胞分离和培养方法

说明书

本发明公开了一种橘色双冠丽鱼黑色素细胞分离和培养方法，针对橘色双冠丽鱼黑色素细胞，选用了胰蛋白酶和胶原酶I共同处理，用胰蛋白酶预消化鱼体表组织，去除表皮细胞，再用胶原酶I配制的胶原酶溶液进行二次处理，结合不同滴度浓度的percoll分层，获得活力较高的色素细胞。成功传代10代，细胞仍可以维持良好的生长状态，而且可冻存和复苏。为利用体外培养的黑色素细胞研究鱼类体色形成的分子机理，为鱼类体色分子育种提供技术支持和奠定理论基础。

技术领域

本发明属于水产动物技术领域，特别涉及一种橘色双冠丽鱼黑色素细胞分离和培养方法。

背景技术

动物色素细胞是动物体色形成研究的重要载体。因此，能否成功提取、分离和体外培养色素细胞是探究动物体色基因生物学功能的基础，也是了解鱼类体色形成和体色变异分子机理的前提。1982年Eisinger等研究者使用0.25％胰酶消化处理人包皮后，再添加十四烷酰佛波醇乙酸酯(TPA)、霍乱毒素(CT)，首次提取、分离和体外培养了人黑色素细胞。Tamura通过人胚胎提取物和TPA成功从小鼠皮肤获得黑色素细胞。白瑞采用Dispase II酶和0.02％胰酶/EDTA两步消化处理提取和培养羊驼皮肤黑色素细胞。田颖刚以DMEM为培养基，采用胰蛋白酶、胶原酶I和中性蛋白酶消化并进行细胞产量和贴壁情况评估，添加TPA、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、胎牛血清(FBS)获得更具细胞产量和细胞活力的乌骨鸡皮肤黑色素细胞。鲍加荣以K-SFM为培养基，加入TPA、BFE和bEGF等培养液，获得了接近生理状态的狐黑色素细胞。现有技术中，研究学者成功从哺乳动物如人、小鼠、羊驼和狐等皮肤分离和培养黑色素细胞，但难以从鱼体体表中提取分离色素细胞，目前还未见确切的鱼类某种色素细胞的单独分离培养相关报道。

研究学者通常使用不同消化酶对鳞片组织进行消化处理，消化酶一般采用Dispase II酶、胶原酶I、中性蛋白酶和胰蛋白酶等处理，其中Dispase II酶相对来说对皮肤组织消化不太全面，多应用于研究哺乳动物眼睛黄色素细胞分离培养中；中性蛋白酶虽能选择性作用于纤维蛋白、黏连蛋白和IV型胶原，破环板桥里的结构，但对于桥粒结构作用却很少，因此也不能将表皮完全分散；胶原酶I能作用于结缔组织中的胶原蛋白，对细胞间质产生消化作用，且对细胞本身影响不大，能使细胞保持高活力；胰蛋白酶能水解细胞间质中的蛋白质，破环细胞间的半桥粒和桥粒结构，从而使细胞分散，但其对细胞本身有损伤。但是鱼类与哺乳动物的色素细胞不同，鱼类色素细胞难以分离。

根据现有需要，开发一种橘色双冠丽鱼黑色素细胞分离和培养方法成为亟需解决的问题。

发明内容

本发明的首要目的在于提供一种橘色双冠丽鱼黑色素细胞的分离方法。

本发明第一个方面，提出了一种橘色双冠丽鱼黑色素细胞的分离方法。根据本发明的实施例，该构建方法为：将双冠丽鱼鱼尾鳍、皮肤、鳞片放入胰蛋白酶中进行消化，收集细胞，再放入胶原酶中进行消化，加入不同浓度percoll试剂，收集细胞进行原代培养和传代培养即可获得橘色双冠丽鱼黑色素细胞。发明人发现，只用胰蛋白酶消化鱼体表组织的时候，延长消化时间即过夜处理(超过6h)，鱼体表组织依然消化不完全，表现为剪碎后转入25um气孔尼龙网过滤分裂组织，并且增加离心时间所获得细胞液体较清澈，镜检里面所含细胞少量；且通过percoll试剂低速离心分离后，镜检所得细胞亦少量；最后进行原代培养时，镜检色素细胞增殖、生长慢。为了取得进一步的效果，发明人进行了优化，惊奇地发现，通过用含有牛血蛋白、胶原酶I、DNase I、以及大豆胰蛋白酶抑制剂的胶原酶溶液进行二次消化，色素细胞得到密度增大了2-3倍、原代培养时增殖、成长速度快了1倍。解决了只用胰蛋白酶溶液处理而导致表皮细胞等去除不完全影响提取到的色素细胞的细胞高密度和活力的问题。

根据本发明的实施例，包括以下步骤：

1)组织消化：将双冠丽鱼鱼尾鳍、皮肤、鳞片放入胰蛋白酶消化，收集细胞，再加入胶原酶中消化，收集消化后的细胞；再依次加入55％percoll试剂、45％percoll试剂、35％percoll试剂，离心收集最上层细胞；