[发明专利]一种猫细小病毒重组蛋白及其单克隆抗体的制备

说明书

本发明属于生物工程技术领域。本发明涉及一种猫细小病毒重组蛋白，该猫细小病毒重组蛋白包含猫细小病毒(FPV)抗原的两个优势表位，为提高该重组蛋白在原核表达系统中的产量，采用大肠杆菌偏爱密码子将该重组蛋白氨基酸序列转换为对应的核苷酸序列，化学合成该核苷酸序列并构建重组表达载体。本发明还涉及该猫细小病毒重组蛋白单克隆抗体的制备，经过免疫、细胞融合及多轮筛选后得到杂交瘤细胞株，纯化单克隆抗体并分别标记胶体金颗粒，通过正交实验确定最佳单抗配对组合，可用于猫细小病毒感染的早期诊断。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域。具体来说，本发明涉及一种新的猫细小病毒重组蛋白，通过基因工程技术编码合成该猫细小病毒重组蛋白的核苷酸序列，构建含有上述核苷酸序列的质粒载体，转化有上述质粒载体的大肠杆菌菌株，表达猫细小病毒重组蛋白；使用上述重组蛋白制备单克隆抗体，并应用于猫细小病毒感染的初步诊断。

背景技术

猫细小病毒(Feline parvovirus，FPV)又称猫泛白细胞减少症病毒、猫传染性肠炎病毒、猫瘟病毒，猫感染细小病毒后的临床表现主要为高热、呕吐、腹泻和肠炎，能够导致白细胞数目严重减少。该病毒主要感染猫科和鼬科等多种动物，尤其以6月龄以下幼小动物的发病率和死亡率更高，是目前细小病毒属中感染范围最广，致病性最强的一种病毒。

自然条件下，感染动物特别是发病动物的粪便、尿等排泄物和鼻、眼、唾液等分泌物以及呕吐物均带毒，可污染饲料、饮水、器具和周围环境。当感染动物血清中存在FPV抗体时，其粪尿仍可向外界排毒6周之久。随着猫细小病毒危害的加重，许多研究人员对其开展了实验室诊断。主要有猫细小病毒的分离鉴定，该方法利用培养细胞来观察细胞病变，但有些病毒增殖缓慢，不能在细胞培养物中生长，与临床发病时间相比，排毒时间可能很短，而在样本贮存和运输过程中，可能丧失感染性，并且该方法需要操作者有一定的经验，花费较高。电镜检查试验敏感度较低，不能区别形态类似的不同病毒，且样本处理量大，限制了该方法的应用。RT-PCR法检测猫细小病毒核酸，该方法特异性和敏感性好，能快速区分病毒，适合大量样本同时检测，但是设备昂贵，对操作人员要求高，检测时间较长，并且检测费用高。

目前，免疫学方法检测猫细小病毒由于操作简便、结果易于判定，已成为主流方向。免疫学方法采用单克隆抗体识别检测血液样本中的猫细小病毒抗原，该方法特异性及灵敏度俱佳。若结合胶体金平台，一般能在10～15分钟内获得准确结果，适合大批量样本快速检测，无特殊设备及人员要求，主人在家就可以检测。

发明内容

设计目的：通过设计一种猫细小病毒重组蛋白并制备其单克隆抗体，从而实现猫细小病毒的特异性识别检测，既增强了检测灵敏度，又不会导致检测结果失真。

设计方案：为了实现上述设计目的。本申请：(1)以猫细小病毒衣壳蛋白为靶抗原，分析并选择该抗原的两个特异性优势表位，序列比对结果显示所选择的两个抗原表位与其它蛋白序列无明显同源性。(2)为了促进所选择优势抗原表位对Balb/c小鼠免疫系统的刺激，增强免疫效果，将所选择的两个优势抗原表位序列通过柔性片段(连续四个甘氨酸)串联后四次重复，形成猫细小病毒重组蛋白氨基酸序列。(3)采用大肠杆菌偏爱密码子，将猫细小病毒重组蛋白氨基酸序列转换为对应的核苷酸序列，以利于该重组蛋白在大肠杆菌中的高效表达。(4)化学合成上一步骤得到的核苷酸序列，并通过酶切连接，将合成得到的核苷酸片段插入原核表达载体pET-28a(+)，构建重组蛋白表达载体。(5)猫细小病毒重组蛋白表达载体转化大肠杆菌ER2566感受态细胞，利用卡那青霉素抗性筛选培养基筛选得到重组蛋白表达菌株。(6)重组蛋白表达菌株大规模培养后，超声破菌并低温离心，取溶液上清通过镍琼脂糖亲和层析柱亲和层析，洗脱得到纯化的猫细小病毒重组蛋白。(7)纯化的猫细小病毒重组蛋白多次免疫Balb/c小鼠后，取其脾脏细胞与sp2/0骨髓瘤细胞融合，经多轮筛选并最终得到杂交瘤细胞株。(8)将杂交瘤细胞株分别制备Balb/c小鼠腹水，使用正辛酸-硫酸铵沉淀法及Protein A亲和层析分两步纯化单克隆抗体，并分别标记胶体金颗粒。(9)正交实验筛选显示3A6单抗包被与7B9胶体金标记单抗配对是检测猫细小病毒感染的最佳组合。