[发明专利]肿瘤光热-免疫联合治疗DNA纳米制剂的方法

说明书

本发明公布一种肿瘤光热‑免疫联合治疗DNA纳米制剂的方法，主要步骤包括:1)DNA‑A与核酸适配体聚合物链的制备；2)CPG‑ODN聚合物链的制备；3)DNA‑A聚合物链与CPG‑ODN聚合物链与Linker DNA碱基互补，可交联形成DNA微凝胶纳米颗粒。同时加入吲哚菁绿(ICG)光热剂，交联形成包裹ICG的微凝胶颗粒；4)化疗药物DOX的装载。其中DNA‑A溶液中混合核酸适配体，形成了具有核酸配适体的DNA‑A聚合物链。该微凝胶纳米颗粒将化学治疗与免疫治疗联合，极大地增强肿瘤治疗的效果，使肿瘤治疗更加彻底。

技术领域

本发明涉及纳米制剂制备技术领域，具体为利用DNA碱基互补配对的原理，使DNA-A和CpG-ODN与连接DNA相连，从而合成肿瘤治疗纳米制剂的方法。

背景技术

微凝胶是尺寸在微米或纳米级别的聚合物胶体颗粒，它具有负载效率高、生物相容性好以及生物稳定性优异等特点。而且微凝胶对外界刺激的灵敏度更高，能够通过较大的形变快速响应外界环境的变化。这些特点都使微凝胶在药物输送领域具有很大的优势和潜力。现在大多采用化学试剂作为微凝胶颗粒的交联剂，而化学试剂的潜在毒性限制了凝胶颗粒在人体内的应用。

本发明采用碱基互补配对的机理，使DNA-A和CpG-ODN与Linker DNA相连，从而交联形成微凝胶颗粒。生物相容性优异，对人体无毒无害，开辟了交联剂应用的新思路。

核酸适配体是一段DNA序列。通常是利用体外筛选技术--指数富集的配体系统进化技术从核酸分子文库中得到的寡核苷酸片段。核酸适配体能与多种目标物质高特异性、高选择性地结合，因此被广泛应用于生物传感器领域。本发明合成的微凝胶的粒径在100nm以下，通过静脉注射后会聚集在肿瘤部位，具有对肿瘤的被动靶向作用。且DNA-A聚合物链上的靶向4T1肿瘤表面的核酸适配体，可以实现对肿瘤的主动靶向，从而更高效地把化疗药物输送至肿瘤部位，并且减少对正常组织的伤害。

细菌DNA具有广谱的免疫刺激作用,有实验证明人工合成的CpG-ODN可以模拟细菌DNA诱发机体产生强烈的Th1型免疫应答,CpG-ODN作为一种新型的免疫佐剂已成为分子免疫学研究的热点之一。该微凝胶纳米颗粒将化学治疗与免疫治疗联合，极大地增强肿瘤治疗的效果，使肿瘤治疗更加彻底。

发明内容

本发明涉及一种利用DNA碱基互补配对的原理，使DNA-A和CpG-ODN与连接DNA相连，从而合成肿瘤治疗纳米制剂的方法。

本发明的技术方案是肿瘤光热-免疫联合治疗DNA纳米制剂的方法，通过DNA碱基互补配对合成包裹化疗药物的微凝胶纳米颗粒,具体步骤如下：

1)DNA-A@核酸适配体聚合物链的制备；

2)CpG-ODN聚合物链的制备；

3)ICG@DNA微凝胶的制备及收集。

4)将微凝胶粉末溶于3ml 20-40mg/ml的DOX溶液中透析，以300r/min速度搅拌过夜，1000r/min十分钟离心收集。

2、根据权利要求1所述的肿瘤光热-免疫联合治疗DNA纳米制剂的方法，其特征是，所述步骤1)具体如下：

(1)室温下，将4uL 10-12mg/ml的DNA-A水溶液，3uL 5-8mg/ml的核酸适配体水溶液，2uL 1-2mg/mL的N-异丙基丙烯酰胺，1uL 1％2-羧基-40-(2-羧乙氧基)-2-甲基-苯丙酮引发剂水溶液，10-15uL的Tris缓冲液(pH＝8.0)和25-30uL的超纯水混合，以400rpm速度搅拌；

(2)随后该混合溶液在波长为365nm的紫光灯下照射5min。

所述步骤2)具体如下：