[发明专利]一种结构光照明超分辨显微芯片的成像方法

说明书

本发明公开了一种结构光照明超分辨显微芯片的成像方法，该方法包括如下步骤：步骤一：将两束相干光束分别打到成对的光栅上；发生干涉之后产生的结构光照明样品产生调制的荧光分布图并采集其照片。步骤二：调整两束相干光的光程差，使干涉之后产生的结构光发生两次平移并分别采集调制的荧光分布图照片。步骤三：两束相干光束切换到不同方向不同周期的成对光栅，重复步骤一和二。步骤四：对步骤三中得到的所有调制的荧光分布图照片对应的空间频谱信息在频域空间进行迭代拼接，得到扩大后的频谱，最后进行反傅里叶变换重构出超分辨的样品图像。本发明器件衍射结构所在的平面与样品放置的平面能够有效分离，有利于芯片的重复利用。

技术领域

本发明涉及超分辨显微领域，尤其涉及一种结构光照明超分辨显微芯片的成像方法。

背景技术

传统光学系统受到阿贝衍射极限的限制，导致显微镜分辨率只能达到照明波长的一半。为了突破传统显微镜的衍射极限，人们发明了一系列的荧光标记和非荧光标记方法。其中移频技术可以突破传统成像与探测器件的带宽限制，在视场大、速度快上具有显著优势。结构光照明超分辨显微术属于移频技术，凭借其成像速度快、较低的激发光强(W/cm²)、对荧光染料的非特异性需求等优点，已经成为目前主流的超分辨成像技术之一，广泛应用于生物成像。

传统的显微光学系统可以看作为一个低通滤波器，其空间频率带宽由光学传递函数决定，空间频率高于这一带宽的信息都不可以通过。结构光照明超分辨显微术通过空间频率混合的方式将物体的高频空间结构信息混合编码至显微系统的带宽范围内，从而可以实现突破衍射极限的分辨率。其实现方式是利用调制光场作为样品激发光，能够实现的最大分辨率取决于这个调制光场的周期。照明光场的周期越小，则可以实现的分辨率越高。普通的结构光照明显微技术利用物镜耦合双光束产生干涉条纹，其条纹周期取决于物镜的有效数值孔径。为了增加物镜的有效数值孔径，往往需要匹配高折射率的溶液，然而自然界中液体的折射率有限，因而限制了这种超分辨方法的分辨率。此外，增大有效数值孔径还会带来成像视场面积的减小和显微镜工作距离的缩短。因而基于物镜耦合双光束方式实现的结构光照明显微术的应用受到了限制。

解决此矛盾的思路是将照明系统和接收系统分离，其中照明系统可以采用高折射率的芯片提供更小周期的结构光照明，接收系统用数值孔径较小的物镜，因此可以同时获得较大的成像视场和较高的分辨率。

公开号CN201811455370提出的基于光波导薄膜的结构光照明超分辨显微芯片，但该方法中样品与波导薄膜在芯片的同一面，不利于芯片的重复利用，此外，该方法中的光波导薄膜厚度只有一两百纳米，部分高折射率材料在薄膜制备上存在困难，但可以很容易制备成块状单晶材料。本发明提出采用块状单晶光波导材料制备结构光照明超分辨显微芯片的方案，在光波导的一面制备衍射单元，另一面抛光面作为样品成像面，可以实现芯片功能面与成像面的有效分离。

发明内容

本发明目的在于针对现有结构光照明显微技术的不足，提出一种结构光照明超分辨显微芯片的成像方法。本发明基于块状高折射光波导材料，在波导表面制备衍射结构，利用衍射效应将两束自由空间光耦合进波导材料，利用高有效折射率倏逝场产生的干涉结构光对样品进行照明，将物体高频空间频谱信息进而调制移频到低频被显微物镜接收，再恢复出样品的超分辨显微图。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种结构光照明超分辨显微芯片的成像方法，该方法基于结构光照明超分辨显微芯片实现，所述超分辨显微芯片包括：两面平行的衬底材料，衬底材料在所选照明波段是透明的，其中一个表面是功能表面，上面刻有m圈成对分布的光栅结构，另一个表面是成像平面，用来放置样品，对芯片的成像平面进行抛光处理，提高全反射的效率和倏逝场的均匀度；成像平面的成像区域正对于功能表面的光栅圈的中心；第m圈光栅圈的直径为：

其中T是衬底材料的厚度，λ是使用的照明光波长，n是衬底材料的折射率，P_m是第m圈光栅的周期,是入射光与波导法线的夹角。