[发明专利]一种双光子扫描结构光显微成像方法及装置

说明书

本发明提供了一种双光子扫描结构光显微成像方法及装置，通过将激光调制成光强随时间按正弦函数周期性变化的激发光，并使用调制后的激发光对待成像样品进行扫描，形成扫描结构光激发；采集待成像样品被激发光扫描激发产生的荧光信号，得到荧光信号对应的非正弦荧光结构光图像，并提取荧光结构光图像的频率分量；根据不同方向上的荧光结构光图像的频率分量的叠加重构得到待成像样品的超分辨率图像，本实施例的方法不需要对荧光饱和激发和高功率的附件STED光就可以实现比线性结构光双光子超分辨显微镜更高的分辨率成像，分辨率比衍射极限提高3倍甚至更高，因此可以满足几十纳米甚至更高的双光子荧光成像需求，提高双光子荧光图像分辨率。

技术领域

本发明涉及光学显微成像技术领域，尤其涉及的是一种双光子扫描结构光显微成像方法及装置。

背景技术

近年来，随着高强度激光、高灵敏探测器等光电器件研制技术以及新型荧光探针开发等相关领域的快速发展，超分辨显微成像技术取得了令人瞩目的巨大成就，曾经被认为是不可逾越的衍射极限不再是获得生物标本高分辨率信息的障碍。超分辨显微成像技术改变了传统的光学显微成像，打破了Abbe的衍射极限，为光学研究生物成像的纳米结构提供了一个独特的平台。现在有几种方法能够很好地解决衍射极限：光激活定位显微镜(photo-activation localization microscopy,PALM)，随机光学重构显镜(stochasticoptical reconstruction microscopy,STORM)，Stimulated emission depletion(STED)microscopy以及受激发射损耗(stimulated emission depletion,STED)技术、结构光照明显微镜(structured illumination microscopy,SIM)技术。PLAM,STORM,STED方法分辨率都可以达到10nm，但PLAM，STORM为了获得超分辨的图像，平均需要获取几千张raw images，成像速度受限，通常只能用于固定细胞，到目前为止仍难以对生物活细胞实时探测成像。STED成像速度取决于扫描速度，可以适应活细胞成像的需求，然而STED光功率密度相比STORM光功率密度要高4-6个数量级，因此对活细胞的光毒性和光损伤比较严重，且高功率STED光在实现荧光擦除的同时也加剧了荧光分子的光漂白，这些也限制了STED在活细胞成像中的应用。SIM属于宽场显微成像，不需要扫描，成像速度快，无特殊标记，对激发光功率要求不高(其激光功率密度比STORM/PALM技术还要低2-3个数量级)，光漂白和光损伤程度小。因此SIM在活细胞成像方面具有独特的优势。线性SIM的分辨率最多能在衍射极限基础上提高2倍。

基于双光子的扫描结构光显微技术(2P-SPIM)利用飞秒激光在样品上产生双光子激发效应，使用强度调制器调制飞秒激光的脉冲峰值随时间按正弦函数变化，并结合振镜扫描，在样品上产生强度正弦变化的双光子荧光，然后利用线性结构光重构算法获取超分辨图像，分辨率比衍射极限最多提高2倍。而且，目前存在的基于双光子的扫描结构光显微技术要么控制时间调制频率ω_t大于系统传递函数截止频率(ω_t取决于EOM和扫描速度，目的是使产生的谐波落在有效双光子传递函数以外)；要么控制调制图案为正弦开方形式，避免谐波的产生，但是由于谐波的产生与分辨率相关联，抑制谐波产生的同时，限制了分辨率的提高，因此现有技术中的双光子扫描结构光显微技术实现超分辨均需要使荧光满足正弦强度分布，因此，导致其分辨率的提高最多不超过2倍衍射极限(即线性扫描结构光的分辨率)，不能满足人们对几十纳米甚至更高分辨率的超分辨率图像获取的需求。

因此，现有技术有待于进一步的改进。

发明内容

鉴于上述现有技术中的不足之处，本发明提供了一种双光子扫描结构光显微成像方法及装置，克服现有双光子扫描结构光的分辨率的提高最多不超过2倍衍射极限的限制，不能满足人们对几十纳米甚至更高分辨率的双光子荧光超分辨率图像获取的需求，限制了双光子显微技术的应用。

第一方面，本实施例公开了一种双光子扫描结构光显微成像方法，其中，包括：