[发明专利]一种氨肽酶LapA定点突变蛋白及其应用

说明书

本发明公开了一种氨肽酶LapA定点突变蛋白及其应用，属于蛋白质工程技术领域，本发明基于对LapA结构的研究结果，发现了影响LapA底物识别性的关键位点，通过对LapA突变蛋白的研究，利用定点突变技术，获得了氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的嗜肺军团菌氨肽酶LapA的第386位突变体蛋白，经过突变的蛋白不仅保留了原蛋白的水解作用，还对N末端为赖氨酸的蛋白质和多肽具有水解作用，扩展了LapA底物识别的范围，为氨肽酶LapA的产业化和应用广泛化奠定了良好的基础。

技术领域

本发明涉及的是蛋白质工程技术领域，尤其涉及的是一种氨肽酶LapA定点突变蛋白及其应用。

背景技术

氨肽酶(EC 3.4.11)是外切蛋白酶家族的成员，可以选择性地从肽中去除N端氨基酸残基。氨肽酶已成为提高蛋白质水解效率的重要途径，当蛋白质大分子酶解时，肽链中含有的疏水性氨基酸暴露出来，接触味蕾而呈现苦味，而这些疏水性氨基酸一般位于肽链末端，而利用氨肽酶进一步水解蛋白质水解液，可以脱去其苦味。

嗜肺军团菌氨肽酶LapA根据其催化机制属于金属氨肽酶中的M28家族，蛋白质结构如图1所示，嗜肺军团菌氨肽酶LapA对底物识别具有一定偏好性，主要水解N末端为亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸的蛋白质和多肽。LapA底物识别的特异性限制了其成为应用广泛的氨肽酶，应用范围受到限制。

定点突变是指通过聚合酶链式反应(PCR)方法向目的DNA片段(质粒或基因组)中引入所需变化，包括碱基的添加、删除、点突变等。定点突变技术已成为目前生物、医学等领域研究中的一种重要实验手段，是改造、优化基因的便捷方案，也是研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系的有力工具。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，通过对嗜肺军团菌氨肽酶LapA突变体的研究，得到一种能够提高LapA底物识别广泛性的突变蛋白，即提供了一种氨肽酶LapA定点突变蛋白及其应用，以改变氨肽酶LapA蛋白底物识别偏好性。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明提供了一种氨肽酶LapA定点突变蛋白，该突变蛋白具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，该突变蛋白为嗜肺军团菌氨肽酶LapA的定点突变蛋白，嗜肺军团菌氨肽酶LapA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，即本发明的突变蛋白为嗜肺军团菌氨肽酶LapA蛋白的第386位的组氨酸突变为天冬氨酸，命名为氨肽酶LapAH386D，该突变改变了氨肽酶底物识别特异性，使得突变蛋白既能识别亮氨酸对硝基苯胺(Leu-pNA)底物，又能识别赖氨酸对硝基苯胺(Lys-pNA)底物。

本发明还提供了一种上述氨肽酶LapA定点突变蛋白的编码基因，该基因具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

本发明还提供了一种上述氨肽酶LapA定点突变蛋白在水解N末端为赖氨酸的蛋白质和多肽中的应用。

本发明还提供了一种上述氨肽酶LapA定点突变蛋白的获得方法，包括以下步骤：

(1)以含有嗜肺军团菌氨肽酶LapA编码基因的质粒为模板，采用全质粒定点突变方法，以突变引物为特异性扩增引物，进行PCR扩增，获得突变蛋白的编码基因；

(2)将步骤(1)获得的突变蛋白的编码基因连接至经DpnⅠ消化甲基化的模板质粒，获得重组表达质粒；

(3)将步骤(2)的重组表达质粒导入感受态细胞中进行蛋白表达并纯化，获得所述突变蛋白。

作为本发明进一步的优化方案，所述步骤(1)的突变引物为：

上游引物：5'TGAAACCAGTTTCGCTGATGACAACCCATACAT 3'

下游引物：5'AAGAAGTATGGATGTATGGGTTGTCATCAGCGAA 3'。