[发明专利]一种提高嘌呤操纵子pur基因表达量的突变体及其构建方法与应用

说明书

一种提高嘌呤操纵子pur基因表达量的突变体及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。针对嘌呤从头合成途径中，嘌呤操纵子pur的转录抑制以及嘌呤化合物难以积累的问题，本发明提供了一种提高嘌呤操纵子pur基因表达量的突变体，所述突变体是通过敲除大肠杆菌中的DNA结合转录二组分调控因子arcA(Genbank登录号为948874)构建获得的，本发明还利用上述突变体作为出发菌株，过表达突变的PRPP合成酶基因prs和突变的PRPP转酰胺酶基因purF，构建获得高产次黄嘌呤的重组菌。本发明首次实现了调控因子arcA在嘌呤操纵子pur基因表达的调控和在嘌呤生物合成中的应用。

技术领域

本发明涉及一种提高嘌呤操纵子pur基因表达量的突变体及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

嘌呤类化合物是细胞内重要生命活性物质，在细胞内遗传物质的合成与传递、信号转导、能量供应等均具有重要作用。另外，嘌呤类化合物作为前体可以合成多种药物，在疾病的诊断和治疗以及生命科学研究等领域也有广泛的应用。例如早期的巯基嘌呤类药物，以及后期的氟达拉滨、克罗拉滨等嘌呤类核苷药物在癌症治疗方面发挥重要作用。

嘌呤的从头合成路线早已探明，嘌呤的从头合成主要以谷氨酰胺和5-磷酸核糖焦磷酸(PRPP)为前体，经过10步反应合成第一个带有嘌呤环的化合物次黄嘌呤核苷酸(IMP)，IMP进一步转化为不同的嘌呤化合物及嘌呤类核苷酸。大肠杆菌中IMP生物合成的相关基因大部分以嘌呤操纵子pur形式存在。嘌呤的从头合成受到转录阻遏调控、关键酶的反馈抑制调控等多层次、不同水平的严密调控，导致细胞内嘌呤的积累非常低。其中嘌呤操纵子pur的转录抑制是限制嘌呤合成基因表达和嘌呤化合物积累的重要因素。因此提高嘌呤pur操纵子的基因表达水平是提高嘌呤类化合物及其衍生物生物合成的重要途径。

DNA结合转录二组分调控因子ArcA在嘌呤操纵子pur基因表达的调控作用和在嘌呤生物合成中的应用暂无报道。

发明内容

针对嘌呤从头合成途径中，嘌呤操纵子pur的转录抑制以及嘌呤化合物难以积累的问题，本发明将全局调控因子ArcA首次应用于嘌呤操纵子pur的调控，提高嘌呤操纵子pur的基因表达水平和嘌呤化合物的生物合成，技术方案如下：

首先本发明提供了一种提高嘌呤操纵子pur基因表达量的突变体，所述突变体是通过敲除大肠杆菌中的DNA结合转录二组分调控因子arcA构建获得的，所述DNA结合转录二组分调控因子arcA，Genbank登录号为948874。

本发明还提供了上述突变体的构建方法，利用P1噬菌体转导法在大肠杆菌基因组中敲除DNA结合转录二组分调控因子arcA，构建获得突变菌株E.coli △arcA。

优选地，所述大肠杆菌为E.coli W3110。

本发明还提供了一种高产次黄嘌呤的重组菌，所述重组菌过表达突变的PRPP合成酶基因prs和突变的PRPP转酰胺酶基因purF，出发菌株为上述的敲除了大肠杆菌中的DNA结合转录二组分调控因子arcA的大肠杆菌突变体。

进一步地限定，所述突变的PRPP合成酶基因prs，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述突变的PRPP转酰胺酶基因purF如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了上述高产次黄嘌呤的重组菌的构建方法，步骤如下：

1)突变的PRPP转酰胺酶基因purF的制备：