[发明专利]监测线粒体自噬的罗丹明类pH荧光探针及制备和应用

说明书

本发明涉及pH荧光探针技术领域，具体涉及监测线粒体自噬的罗丹明类pH荧光探针及制备和应用。为了解决许多检测溶酶体pH变化的荧光探针不适合对细胞进行长时间的监测，能够实际用于线粒体自噬的监测的溶酶体靶向pH荧光探针甚少等问题，本发明提供了一种制备方法：将罗丹明B的N‑对甲苯磺酸乙酯衍生物和N‑氨基吗啉溶于二氯甲烷中，加热回流，冷却至室温，减压旋蒸除去溶剂制得粗品，将粗品经硅胶柱色谱提纯得到淡黄色固体为pH荧光探针。该荧光探针具有良好的细胞膜渗透性，能够靶向标记溶酶体，且通过检测溶酶体pH的变化实现对线粒体自噬过程的可视化监测，在溶酶体pH生理学和病理学研究中具有潜在的应用前景。

技术领域

本发明涉及pH荧光探针技术领域，具体涉及监测线粒体自噬的罗丹明类pH荧光探针及制备和应用。

背景技术

自噬(autophagy)是指从粗面内质网的无核糖体附着区脱落的双层膜包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等成分形成自噬体(autophagosome)，并与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物，以实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新。线粒体在生物氧化和能量转换过程中会产生活性氧，线粒体DNA又比核DNA更容易发生突变，因此线粒体是一种比较容易受到损伤的细胞器。及时清除细胞内受损的线粒体对细胞维持正常的状态具有重要的作用。细胞主要通过线粒体自噬来清除损伤或衰老的线粒体，以使细胞内线粒体的质量和数量保持平衡，因而对于维持细胞稳态及细胞生存具有重要意义。

一般来说，线粒体自噬发生时，线粒体会被自噬体吞噬并与溶酶体结合，由于线粒体和溶酶体的差异，溶酶体内的pH值等微环境会发生变化。因此，我们可以通过检测溶酶体内pH的变化来监测线粒体自噬进行的程度。众所周知，荧光分子探针结合激光共聚焦显微镜成像技术，具有非破坏性、高灵敏性、操作简便、以及高信噪比等特性，已经成为分子水平上实时原位监测细胞内pH变化的重要手段。

目前文献报道了许多检测溶酶体pH变化的荧光探针，然而由于这些探针的激发和发射波长大多处于紫外和近可见区域，与细胞自发荧光相互交叠，造成背景荧光较强，且紫外光对细胞的毒副作用较大，因而不适合对细胞进行长时间的监测。其次，能够实际用于线粒体自噬的监测的溶酶体靶向pH荧光探针甚少。因此，需要开发新型的溶酶体靶向pH探针用于线粒体自噬过程的检测。本发明以具有优良pH响应荧光性质的罗丹明B为荧光团母体结构，并引入溶酶体靶向吗啉环基团，设计合成了新型pH荧光探针MSO，通过对细胞溶酶体内pH的特异性检测实现对线粒体自噬过程的监测。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种监测线粒体自噬的罗丹明类pH荧光探针的制备方法；目的之二是提供监测线粒体自噬的罗丹明类pH荧光探针的应用，即用于制备动物细胞线粒体自噬过程中溶酶体内pH变化的检测试剂。

为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：

一种监测线粒体自噬的罗丹明类pH荧光探针为3'，6'-双(二乙胺基)-2-(2-(氨基吗啉)乙基)螺[异二氢吲哚-1,9'-呫吨]-3-酮，结构式为：

一种监测线粒体自噬的罗丹明类pH荧光探针的合成路线为：

一种监测线粒体自噬的罗丹明类pH荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

(1)按现有技术制备罗丹明B的N-对甲苯磺酸乙酯衍生物，参考文献：Hong-ShuiLv；Jing Liu；Jing Zhao；Bao-Xiang Zhao；Jun-Ying Miao,Sensors and Actuators,B:Chemical(2013),177,956-963；

(2)将罗丹明B的N-对甲苯磺酸乙酯衍生物和N-氨基吗啉溶于二氯甲烷中，加热回流反应，体系冷却至室温，减压旋蒸除去溶剂制得粗品；