[发明专利]抗Ep-cam蛋白单克隆抗体、细胞系及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及一种抗Ep‑cam蛋白单克隆抗体，所述单克隆抗体的重链和轻链可变区的氨基酸序列分别是SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列。发明人还提供了一种抗Ep‑cam蛋白单克隆抗体的制备方法，选取Ep‑cam蛋白第24位至第265位氨基酸片段并在其C末端添加6个His作为免疫原并进行蛋白重组，所述重组蛋白经由大肠杆菌重组表达。发明人再提供了一株分泌抗Ep‑cam蛋白的杂交瘤细胞系，所述细胞系为小鼠杂交瘤细胞系4B5E6D7，保藏号为：CGMCC NO.17406。所述的抗Ep‑cam蛋白单克隆抗体适用于免疫检测，膜定位准确、特异性强、敏感性强。

技术领域

本发明涉及生物检测领域，特别涉及抗Ep-cam蛋白单克隆抗体、细胞系及其制备方法和应用。

背景技术

1979年在肿瘤细胞表面抗原的研究中发现Ep-cam为胰腺癌抗原。Ep-cam又称为TACSTD1是一种细胞黏附分子,按白细胞分化抗原为CD326，属单次跨膜Ⅰ型糖蛋白。

Ep-cam是由GA733-2基因编码,位于人染色体2p21,基因长度14kbp,成熟的mRNA全长约1.5kb,相对分子量大约为40KD。Ep-cam含有两个上皮生长因子样重复序列,N端半胱氨酸富集,跨膜区为23个氨基酸,胞浆区较短,为26个氨基酸。EpCAM的功能大部分未知,眼下公认的功能是黏附作用,属钙离子非依赖性同型细胞间黏附。研究显示EpCAM和肌动蛋白细胞骨架间通过α辅肌动蛋白相互作用,这可能对黏附和组织形态形成起重要作用。

Ep-cam主要编码一种肿瘤相关抗原，在高等脊椎动物中高度保守,人和小鼠Ep-cam分子的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为80％和82％。Ep-cam分子广泛表达于上皮来源的组织中,具有介导钙非依赖型的同型上皮细胞间粘附的功能。在很多恶性增生的上皮肿瘤中Ep-cam表达的强度远远超过正常组织的表达水平。恶性肿瘤组织不但高表达Ep-cam分子而且Ep-cam阳性细胞无论从数量还是阳性程度上都是与肿瘤发展的程度密切相关的。研究表明，绝大部分的上皮来源的肿瘤组织中都有Ep-cam分子的表达,其中胃和结直肠消化道肿瘤,乳腺癌,卵巢癌,胰腺癌,肺癌,前列腺癌等的Ep-cam阳性率都达到或接近100％，但是在黑素瘤、CNS原发肿瘤、肉瘤、淋巴瘤和干细胞肿瘤中缺乏表达。Ep-cam表达的调节还在研究中,有研究发现肿瘤坏死因子α(TNF-α)在鳞癌中通过核因子κB抑制EpCAM表达,这可能是通过对共活化物转录的竞争性抑制实现的。

Ep-cam分子特异性单抗可以区分上皮和非上皮来源的组织,可以作为上皮型肿瘤的可靠的诊断标志物。如在诊断皮肤基底细胞癌(BCC)和鳞状细胞癌(SCC)时,一种被称为基底鳞状细胞上皮癌的癌症病灶在形态学上有BCC和SCC的混合特点,对BCC中大量表达Ep-cam,而SCC中没有Ep-cam阳性细胞,运用免疫组化的方法用Ep-cam单抗染色,发现BCC中阳性细胞呈广泛和弥散分布,明确的区分这两种不同的病灶。另外,Ep-cam的表达强度还可以作为一些上皮来源肿瘤预后及分化程度的标志。如在胆囊癌中Ep-cam的过表达可以作为独立的标记对预后的生存率作出有效的评价。如在正常宫颈上皮、宫颈上皮内瘤变及宫颈鳞癌中，Epcam表达逐渐增强。因而针对不同的肿瘤分析Epcam的表达情况可以作为肿瘤分化程度的标志。

发明内容

为此，需要提供一种特异性强、敏感性强的识别Ep-cam的抗体。为实现上述目的，发明人提供了一种抗Ep-cam蛋白单克隆抗体，所述单克隆抗体的重链和轻链可变区的氨基酸序列分别是SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列。

进一步地，所述单克隆抗体的重链和轻链可变区氨基酸序列分别是SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列所编码。