[发明专利]一种人羊膜上皮干细胞的分离方法和制备方法

说明书

本发明公开了一种人羊膜上皮干细胞的分离、制备方法及其产物。所述分离方法包括以下步骤：(1)使用重组胰蛋白酶预处理羊膜组织，去除重组胰蛋白酶，得到预处理的羊膜组织；(2)使用重组胰蛋白酶消化步骤(1)所得预处理的羊膜组织，收集消化液；(3)向步骤(2)所得消化液加入消化终止剂，将所得消化液过滤，离心，弃去上清收集沉淀细胞；(4)将步骤(3)所得细胞接种于无血清无动物源培养基体系中，培养扩增后，得到高纯度人羊膜上皮干细胞。发明所述的hAESCs具有分离快速、操作简便和成本低廉等优点，所得hAESCs直接用于科学研究和临床治疗，具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种人羊膜上皮干细胞的分离、制备、无血清培养方法及其产物。

背景技术

羊膜是胎盘的最内层，位于胎儿绒毛膜的表面，是与发育中的胎儿联系紧密的胚胎发育早期产物，也是母体与胎儿间进行物质交换的重要组织。羊膜为半透明的薄膜，有韧性，无神经、血管和淋巴管，包裹着羊水和胎儿，提供胚胎生长发育的环境。其厚度仅为0.02～0.5mm，由上皮层、基底层和基质层(结缔组织层)组成。羊膜的基质层与绒毛膜之间有一层海绵层，由稀疏、松散和并排结合的胶原纤维组成。由于人羊膜和绒毛膜连接很松散，这为从胎盘上分离羊膜提供了有利条件。人羊膜主要分5层：①上皮层，大部分为单层立方上皮，有合成、分泌和沉积基底膜和细胞外间质成分的能力。②基底膜，由狭窄的无细胞网状纤维构成，厚度不一，含I型胶原纤维网，层粘连蛋白和硫肝糖蛋白。③致密层，薄而致密，无细胞，由网织纤维组成。④纤维母细胞层，是羊膜厚度的主要组成部分，由疏松纤维母细胞和网状纤维构成。⑤海绵层，由波浪状网织纤维构成。其中上皮层即为复层上皮细胞。羊膜上皮面高度褶皱，整张羊膜展开可达2m²，含大约2亿个细胞。

羊膜是一种临床使用历史较为悠久的生物医学材料，早在一百多年前就作为一种敷料应用于外科，上世纪初作为一种供体材料应用于外科皮肤移植手术中，1940年Roth用羊膜修补损伤的结膜，Kim和Tseng在1995年把保存的羊膜运用于兔角膜重建术中并取得成功后，人们开始对羊膜的生物学特性有了一个全新的、深入的认识。羊膜移植可用于多种疾病或损伤的治疗，如皮肤烧伤、皮肤溃疡和眼表疾病等。

干细胞(stem cells)是一类具有自我更新能力(self-renewing)的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。干细胞的分类有两种方法，一是根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)和成体干细胞(somaticstem cell，SSCs)。第二种分类方法是根据干细胞的发育潜能分为三类：全能干细胞(totipotent stem cells，TSCs)、亚全能干细胞(pluripotent stem cells，PSCs)、多能干细胞(multipotent stem cells，MSCs)和单能干细胞(unipotent stem cells，USCs)。

羊膜形成于原肠胚之前的受精第8天，与胚胎干细胞具有同一发育组织来源，由内细胞团发育而来，故保留有多能干性。羊膜细胞保持有前原肠胚胚胎细胞的可塑性，羊膜组织主要由来源于外胚层的羊膜上皮和来源于中胚层的羊膜间充质细胞两类细胞组成。人羊膜上皮干细胞具有类似于胚胎干细胞的向内胚层、中胚层和外胚层三种胚原基层细胞分化的潜能，是一种亚全能干细胞(pluripotent stem cells，PSCs)。