[发明专利]一种紫球藻叶绿体表达系统及其应用

说明书

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种紫球藻叶绿体同源重组空载体及其应用。载体包括紫球藻叶绿体基因组上SEQ ID NO:1所示碱基序列的上游同源臂和SEQ ID NO:2所示碱基序列的下游同源臂，SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示碱基序列的启动子，SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示碱基序列的终止子，启动子和终止子之间插入与至少一个外源基因构成多顺反子结构的SEQ ID NO:7所示的碱基序列。采用本发明的紫球藻叶绿体同源重组空载体可实现多个外源基因在叶绿体中稳定表达。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体的说是一种紫球藻叶绿体表达系统及其应用。

背景技术

紫球藻属于红藻门、原红藻纲、紫球藻目、紫球藻科、紫球藻属。紫球藻一种比较原始的且是现今为止所发现的唯一的单细胞红藻。紫球藻分布极广，在海水、淡水、潮湿的土壤中都有发现。紫球藻细胞通常呈球形，直径约为 5-24 μm，细胞内含有一个大而呈星状的载色体，含有丰富的藻胆蛋白，其中以藻红蛋白含量最多，因此细胞呈现红色或暗紫色。紫球藻细胞外通常还含有着一层粘质鞘，即紫球藻多糖，细胞间的紫球藻多糖会相互粘连发生不规则的集聚。当在潮湿的土壤及墙壁上时，紫球藻呈现一种浅褐色或红色的薄片，失水时细胞呈皮壳状。紫球藻细胞以二分裂为生殖方式，属于无性生殖。在海水，咸水，淡水及潮湿的土壤中都能生长繁殖。紫球藻具有极强的抗盐性，能在含盐量高达 3.5~4.6%的环境中正常生长。

紫球藻在生长过程中会合成多不饱和脂肪酸，胞外多糖和藻胆蛋白等高附加值代谢产物，其次细胞内还含有其他代谢产物如：叶绿素、RNA、矿物元素和色素(类胡萝卜素、叶黄素)等活性物质，所以紫球藻具有广泛的应用前景以及巨大的市场潜力。紫球藻中油脂含量可占生物量的 9~16%，其中，多不饱和脂肪酸占总脂质的一半以上，其中二十碳五烯酸(EPA)和花生四烯酸(ARA)含量最多。细胞内的脂肪酸含量和组成成分易受生长环境的影响而发生变化。可以通过控制培养条件，定向的生产某一种具有较高附加值的代谢产物，如ARA和EPA。

紫球藻生长会经过延滞期、对数生长期、稳定期以及衰亡期等四个时期，当细胞进入生长稳定期后，能大量的向胞外分泌藻多糖，并形成一层厚厚的粘性鞘膜，其余的多糖则与培养基互溶，使得培养液呈现粘稠状，对紫球藻细胞有保护作用，但是增加了紫球藻收获的难度。另外，藻多糖的胶质状态具有稳定性，可被广泛应用于临床、食品、化妆品等行业中。紫球藻多糖常为硫酸酯多糖，主要由木糖、葡萄糖和半乳糖等单糖组成，具有阻止病毒吸附的作用，因此在治疗肿瘤上具有特殊的功效。另外，紫球藻多糖还具有预防和治疗心血管疾病、降血脂以及治疗肝、胆、胰等疾病的作用，也被广泛运用于保健品行业，因此紫球藻多糖是一种应用面广、功能效果明显的代谢产物。

紫球藻的另一个重要产物是藻胆蛋白。藻胆蛋白是一种颜色鲜艳的水溶性色素蛋白，聚集成被称为藻胆体的超分子复合物，这些复合物聚集在叶绿体类囊体薄膜的外表面。藻胆蛋白的颜色主要来源于共价结合的亚基基团，这些基团是带有 A，B，C 和 D 环的开链四吡咯发色团，名为藻胆素。藻胆蛋白存在于原核蓝藻和真核红藻中。在蓝藻和红藻中，产生了四种主要的藻胆蛋白：别藻蓝蛋白(APC，蓝绿色)、藻蓝蛋白(PC，蓝色)、藻红蛋白(PE，紫色)和藻红蓝蛋白(PEC，橙色)。在大多数红藻中，藻红蛋白占藻胆蛋白的 70%以上，而在蓝藻中藻蓝蛋白的含量丰富。藻胆蛋白可用于食品色素和食品添加剂。布丁中含有的食品色素大多是化学品制成的，藻胆蛋白作为天然色素，可以作为布丁的着色剂并广泛用于食品中。分析级藻胆蛋白(纯度≥4.0)被报道具有明显的抗氧化、肝保护、抗炎等生物活性。目前，相关研究报道了以δ-氨基酮戊酸、血红素或胆绿素为前体的藻胆蛋白的不同生物合成途径。

目前紫球藻的规模化培养和应用已经开始，但是在生物量和收获方面还有很大的困难。紫球藻代谢机制方面的研究成果很多，紫球藻叶绿体基因组也已经完成，为叶绿体遗传转化提供了数据支持。但缺少遗传转化的工具，包括叶绿体转化的同源插入位点、转化方法、调控序列等，这阻碍了紫球藻的代谢产物开发和应用。

发明内容