[发明专利]一种羊膜间充质干细胞来源的外泌体的提取方法及其应用

说明书

本发明公开了一种羊膜间充质干细胞来源的外泌体的提取方法及其应用。本发明外泌体通过对羊膜的分离、洗涤、除上皮细胞、剪碎、消化、离心取第二层悬液、重悬、接种培养以及后续的抽提制备等步骤得到。该外泌体在作为促进血管化新生骨形成的药物中的应用，能使得血管内皮细胞聚集，血管新生，进而重建微循环增加血流灌注，并且不会引起其他功能的缺失等良好功效，应用前景好；本发明对细胞提取过程进行了优化，羊膜干细胞提取效率更高、纯度更高，获取更多细胞的前提下，能够保证更大量的外泌体的获取。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种羊膜间充质干细胞来源的外泌体的提取方法及其应用。

背景技术

创伤、感染或肿瘤切除引起的骨缺损的修复仍是颌骨缺损面临的主要挑战。自体骨移植的应用，最常见的来自髂骨，被认为是黄金标准。不足在于供体部位的发病率和移植物的大小限制。从健康的骨骼中获取自体移植物的过程增加了手术时间，并可能与潜在的失血和感染风险相关。此外，患者的年龄和代谢紊乱也可能影响自体移植物的质量。内源性间充质干细胞(MSCs)浓度不一致或较低会显著降低自体移植的疗效。因此，有助于克服这些问题的骨组织工程方法近年来引起了人们的兴趣。虽然同种异体骨移植可能比自体骨移植在骨科手术中更有优势，但植入后初期存在血管化不足的问题。在3D组织构建中，宿主血管的长入量通常限制在每天十分之一微米，并且可能需要几周时间才能达到植入支架的中心。此外，炎症反应诱导新生血管容易出现的早期消退。与此同时，移植物内细胞的存活及其与宿主组织的融合强烈依赖于血液微循环提供的营养和氧气交换以及废物的清除。在骨组织中，血管系统还提供矿化过程中所必需的钙和磷酸盐。因此如何促进血管化新生骨的形成成为修复颌骨缺损的重要影响因素。

血管内皮细胞的激活、增殖、迁移；重建形成新的血管和血管网，是一个涉及多种细胞的多种分子的复杂过程。血管内皮生长因子(VEGF)，为单一基因编码的同源二聚体糖蛋白，能直接刺激血管内皮细胞移动、增殖及分裂，并增加微血管通透性。它是针对内皮细胞特异性最高，促血管生长作用最强的有丝分裂原。VEGF与内皮细胞上的两种受体KDR和Flt-1高亲和力结合后，直接刺激血管内皮细胞增殖，并诱导其迁移和形成管腔样结构；同时还可增加微血管通透性，引起血浆蛋白(主要是纤维蛋白原)外渗，并通过诱导间质产生而促进体内新生血管生成。VEGF在血管发生和形成过程中起着中枢性的调控作用，是关键的血管形成刺激因子。骨是高度血管化的组织，血管生成先于骨生成，是骨生成的先决条件，而与骨化类型无关。在软骨内成骨过程中，肥大的软骨细胞释放血管生成生长因子，诱导软骨内血管的侵袭，形成骨骼的大部分骨骼。新的血管系统有助于软骨模板被骨痂取代。内皮细胞构成血管内层，分泌生长因子，控制破骨细胞、成骨细胞和骨形成细胞的募集。膜内骨化是扁平骨和锁骨发育的基础，也是组织工程骨移植的基础。在膜间骨化过程中，骨组织直接由骨祖细胞凝聚而成，没有软骨作为中介。内皮细胞与这些冷凝物结合形成血管网络，作为骨矿物质沉积的“模板”。此外，骨形成与血管形成的功能依赖不仅发生在骨骼发育过程中，而且还发生在骨重建和愈合过程中。

发明内容

本发明的目的在于提供一种羊膜间充质干细胞来源的外泌体的提取方法及其在作为促进血管化新生骨形成的药物中的应用。

本发明是这样实现的，一种羊膜间充质干细胞来源的外泌体在作为促进血管化新生骨形成的药物中的应用。

优选地，该药物的剂型包括液体剂型和凝胶颗粒型。

优选地，所述药物的剂型为液体剂型，该液体剂型包括所述外泌体和稀释液，所述稀释液为水凝胶或PBS，所述外泌体的浓度为150～200μg/mL。

本发明进一步公开了上述羊膜间充质干细胞来源的外泌体的提取方法，该方法包括以下步骤：

(1)选用人羊膜来源的间充质干细胞进行分离培养与传代

A1、将健康羊膜从胎盘上机械分离后进行洗涤以除去血液和残片；