[发明专利]一种单个活细胞内RNA出核流量的监测方法和系统

说明书

本发明属于分子生物学检测技术领域，具体为一种单个活细胞内RNA出核流量的监测方法及系统。本发明方法包括基因标记、RNA出核流量模型的构建和计算；所述的基因标记，包括在目标基因上进行基因编辑，用于标定目标检测基因，还包括构建合成示踪基因片段，用于表达示踪蛋白特异性结合目标基因及荧光显微监测；构建荧光显微监测过程中示踪蛋白在单个真核生物活细胞核内外的动态平衡模型；根据该动态平衡模型，即可计算监测期内单个或细胞中RNA出核流量。本发明系统包括用户自定义监测变量输入的功能模块，荧光显微图像读取功能模块，荧光图像中真核生物受体细胞的分选、统计功能模块，图像数据处理功能模块。

技术领域

本发明属于分子生物学检测技术领域，具体涉及一种单个活细胞内RNA出核流量的监测方法及系统。

背景技术

RNA是生物体内一种重要的遗传物质，它与基因的转录、翻译过程息息相关，它多由DNA转录而来，又作为模板指导合成氨基酸，从而指导细胞、组织乃至生物体的生长情况、分化方向和表达形状。在现代分子生物学领域研究中，检测不同条件下细胞内的RNA水平极为重要，该水平的变化反映了细胞周期、培养环境、分化方向等条件变化下，细胞遗传物质水平的对应调控机理。

目前，RNA的检测方法多为体外扩增测量和原位荧光杂交技术。体外扩增测量以从大量细胞群体中提取得到的目标RNA为样本，进行扩增后检测得到细胞群体的RNA水平。测量样本来自于大量细胞群体，不能排除必然的个体差异；测量过程包含提取和扩增，不能排除各项体外实验带来的误差，并且势必破坏原测量细胞对象；测量结果反映的也是细胞群体的RNA水平，无法精确到单个细胞。

原位荧光杂交技术是在单个固定细胞内，使用荧光素标记的特异核酸探针计数得到该细胞内的RNA水平。该方法避免了体外提取和扩增，能把RNA的测量水平精确到单细胞层面；但随之而来的是大量繁琐的计数工作，并且该方法要求的固定操作也势必会破坏原测量细胞对象。

另外，对于生物体内存在的micro RNA、lncRNA等多种RNA水平的测量研究，体外扩增测量技术和原位荧光杂交技术存在体外分离提取困难、杂交成功率低等困难。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点和不足，提供一种监测单个活细胞内RNA出核流量的方法及系统，可以在不破坏原测量细胞对象的情况下，监测单细胞水平上目标RNA的出核流量，从而提高RNA检测方法的精细度和时效性，减小检测对原细胞造成的破坏性。

本发明提供的单个真核生物活细胞内RNA出核流量的监测方法，具体包括基因标记、RNA出核流量模型的构建和计算；其中：

所述的基因标记，包括在目标基因上进行基因编辑，用于标定目标检测基因，还包括构建合成示踪基因片段，用于表达示踪蛋白特异性结合目标基因及荧光显微监测；

所述构建RNA出核流量模型，即构建荧光显微监测过程中示踪蛋白在单个真核生物活细胞核内外的动态平衡模型；

所述计算RNA出核流量，根据建立的RNA出核流量模型，计算监测期内单个或细胞中RNA出核流量。

本发明中，所述在目标基因上进行基因编辑，就是采用包括但不限于锌指核酸酶技术、转录激活子样效应物核酸酶技术、规律间隔成簇短回文重复序列核酸酶技术，特异性地识别目标基因上选定的标记靶位点，对其单链或双链进行精准切割后，由细胞内源性的修复机制完成基因标记系统适配子的替换或添加；该适配子具有识别并招募属特定外壳蛋白到基因组位点的特性。所述构建合成示踪基因片段，该片段编码目标真核生物受体细胞核定位序列、能与适配子特异性结合壳蛋白以及各类荧光标记物；具体采用转染、感染或注射等方式，在真核生物受体细胞内表达前述编辑的目标基因以及示踪基因。成功表达示踪基因的真核生物细胞，能在荧光显微镜下被观测并采集，得到荧光显微强度图像。所述目标真核生物受体细胞包括但不限于哺乳动物细胞和各类真菌。基因标记系统包括但不限于MS2基因标记系统、pp7基因标记系统。