[发明专利]一种拉萨小檗胚性愈伤组织诱导及快速增殖的方法

说明书

本发明公开了一种拉萨小檗胚性愈伤组织诱导以及快速增殖的方法，本发明对特定周期内的拉萨小檗的种子胚在暗条件下进行愈伤组织诱导，本发明以拉萨小檗种子为材料产生的胚性愈伤组织既可用于细胞悬浮培养获得代谢产物，也可以经体细胞胚胎发生或器官发生获得再生植株，进而达到快速繁殖的目的，材料活性高、增殖倍数可达到3～7倍，小檗碱含量稳定，可用于工厂化生产。

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，尤其涉及一种拉萨小檗胚性愈伤组织诱导及快速增殖的方法。

背景技术

拉萨小檗(Berberis hemsleyana Ahrendt)又名三颗针，是小檗科小檗属灌木，主要生长于我国青藏高原高海拔地区，据伊尼岩和卢晓东《拉萨、林芝、山南地区三棵针资源》调查，尤其以日喀则、拉孜、拉萨、山南、林芝地区资源最为丰富,另据贺家仁和刘志斌《甘孜州高等植物》记载，四川巴塘县中心绒地区也有分布。拉萨小檗对环境适应性强，耐旱耐荫，对水分和光照条件要求不严,在海拔3000m至5000m之间的高原地带分布广泛。拉萨小檗根茎部位的皮可入药，主治赤痢、黄疸、咽痛、目赤、跌打损伤。据研究发现，拉萨小檗富含小檗碱(黄连素)，是其主要的药效活性成分，其小檗碱含量在众多小檗属植物中名列前茅。

然而目前对于拉萨小檗的研究多限于野生资源调查及生态学研究，鲜有人工利用方面的报道，现有关于拉萨小檗的已公开技术尚为空白,利用拉萨小檗生产小檗碱可通过植物细胞大规模培养次生代谢产物，应用细胞培养技术将外植体脱分化诱导为愈伤组织并使之大量增殖，产生所需的小檗碱，但这种方式在拉萨小檗上尚未见实际应用。

发明内容

本发明提供一种拉萨小檗胚性愈伤组织诱导及快速增殖的方法。

包括以下步骤：

A挑选采集于10～11月间的颗粒饱满、无损伤的拉萨小檗种子作为外植体；

B对所述外植体进行预处理以及消毒处理；

C将所述外植体在无菌环境下取出完整种子胚。

D将所述种子胚接种到诱导培养基中，进行14～18d第一次暗培养获得愈伤组织。

E对诱导获得的所述愈伤组织中取细胞团接种到增殖培养基中继续第二次暗培养直至形成胚性愈伤。

具体地，所述增殖培养基中每14～21d进行一次继代培养。

作为优选，所述诱导培养基的配方包括B5培养基、KT 0.2～0.4mg/L、NAA 1.0～2.0mg/L、琼脂5.8g/L、蔗糖30g/L，pH条件为5.8。

具体地，所述增殖培养基的配方包括MS培养基、BA 0.2～0.4mg/L、NAA 1.0mg/L，琼脂5.2g/L，蔗糖20g/L，pH条件为5.8。

作为优选，所述预处理包括用0.1～0.15mg/ml赤霉素浸泡24h以打破所述拉萨小檗种子的休眠状态，用清水冲洗20～30min，用滤纸吸除所述拉萨小檗种子表面水分。

具体地，所述消毒包括用70％～75％酒精消毒30s后，用无菌水冲洗2次，再用0.1％升汞消毒10～15min，用无菌水冲洗5次后，使用无菌滤纸吸除拉萨小檗种子表面水分。

作为优选，所述暗培养的培养条件为：保持每天24h遮光，温度22～26℃、相对湿度为75％～95％、气压为60～80kPa、CO₂浓度为1000～1500ppm。

本发明的有益效果为：

本发明以拉萨小檗种子为材料产生的胚性愈伤组织既可用于细胞悬浮培养获得代谢产物，也可以经体细胞胚胎发生或器官发生获得再生植株，进而达到快速繁殖的目的，材料活性高、增殖倍数可达到3～7倍，小檗碱含量稳定，可用于工厂化生产。

附图说明