[发明专利]脐带间充质干细胞的规模化培养方法

说明书

本发明关于间充质干细胞培养技术领域，特别是关于一种脐带间充质干细胞的规模化培养方法，所述方法包括下述步骤：1)复配培养基；2)将脐带间充质干细胞置于步骤1)所述培养基中培养；3)将步骤2)培养所得干细胞置于含有改性醋酸纤维素中空纤维膜的步骤1)所述培养基中培养；4)降温获取并传代培养。本方法可迅速获取大批量的脐带间充质干细胞，利于脐带间充质干细胞的增殖和干细胞特性保持，成脂和成骨诱导分化潜能佳，细胞表面抗原的阳性表达率可维持在相对较高的水平。

技术领域

本发明关于间充质干细胞培养技术领域，特别是关于脐带间充质干细胞的规模化培养方法。

背景技术

脐带间充质干细胞是以人脐带血血清为主体的培养体系的脐带间充质干细胞培养扩增的方法：流式细胞仪检测结果显示，贴壁细胞均表达CD44、CD29，低表达CD106，不表达造血细胞表型CD14、CD34、CD45和内皮细胞表型CD31，也不表达HLA-DR：细胞倍增时间为30h，细胞周期分析表明，G0～G1期和+G2+M期所占比例分别为78.84％和11.16％。作为目前临床干细胞中应用较广泛的干细胞，人脐带间充质干细胞已开展了多种类型疾病的临床应用研究。脐带间充质干细胞(MSCs)具有较高的分化潜能，可向多个方向进行分化。它在骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、内皮和心肌等组织工程方面具有广阔的临床应用前景。有报道从人脐带中分离出MSCs，且细胞含量、增殖能力优于骨髓MSCs，免疫原性比骨髓MSCs低，并且具有取材方便，无伦理学争议等优点，因此越来越受到研究工作者们的关注。干细胞的培养体系主要应用含动物血清(如胎牛血清)的培养基，

传统的人脐带间充质干细胞培养基，添加动物血清以供应细胞生长所需的营养物质，但会给干细胞的生产与科研带来多种不利因素，如：批间差异较大，来源不稳定，需要大量验证工作，价格昂贵，成分不明确，不利于疫苗和单克隆抗体等目的产品的分离纯化，容易被病毒和支原体感染等。无血清培养基是在基础培养基的基础上，加入成分明确的血清替代成分，以满足干细胞的培养要求，同时避免因使用血清带来的诸多不利因素。血清替代成分较复杂，包括生长因子、蛋白等营养成分。无血清培养基是人脐带间充质干细胞走向临床应用的重要条件，也是近年来的研究热点之一。

中国专利CN106520690A“一种无血清干细胞培养基”公开了一种无血清干细胞培养基，包括基础培养基、胰岛素、转铁蛋白、淫羊藿苷、甘氨酰丙氨酸、丙氨酰-L酪氨酸、多聚赖氨酸、维生素E、聚乙烯吡咯烷酮、转化生长因子-β、还原性谷胱甘肽和碳酸氢钠，该培养基能够促进细胞的生长和增殖，并能明显促进干细胞的分化。

中国专利CN105087479A“无血清干细胞培养基及干细胞的培养方法”公开了一种无血清干细胞培养基，包括基础培养基、胰岛素、谷氨酰胺、含铁的食品添加剂、亚硒酸钠、孕酮和丁二胺，同时还公开了一种干细胞的培养方法，包括如下步骤：获取干细胞，采用本发明提供的无血清干细胞培养基进行体外培养。

中国专利CN108220231A“一种干细胞培养基及其制备方法和应用”公开了一种干细胞培养基及其制备方法和应用，所述培养基包括间充质无血清干细胞培养基、血小板裂解液、谷氨酰胺、非必需氨基酸和肝细胞因子，该发明有效解决现有技术的干细胞培养基不适合培养经血干细胞的技术缺陷。

中国专利申请CN 105420182公开了一种无血清的脐带间充质干细胞培养基，包括DMEM培养基、碱性成纤维生长因子、表皮生长因子、胰岛素、白血病抑制因子、L-谷氨酰胺、2-巯基乙醇、亚硒酸钠和纤连蛋白等，通过添加较高含量的纤连蛋白实现了较好的贴壁性能，但细胞增殖速率较慢。

中国专利申请CN 104877963公开了一种无血清的人脐带间充质干细胞培养基，包括IMDM基础培养基，还包括如下组分：重组人胰岛素、重组转铁蛋白、维生素C、人血清白蛋白、成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子、表皮生长因子、胰岛素样生长因子、转化生长因子、纤维连接蛋白、胎球蛋白和β细胞素，通过添加纤维连结蛋白和胎球蛋白增强了人脐带间充质干细胞的贴壁性能，通过添加β细胞素维持人脐带间充质干细胞的干细胞特性，组分较复杂，成本较昂贵。