[发明专利]一种采用重建正常人体三维皮肤模型评价修复功能的体外方法

权利要求书

1.一种采用重建正常人体三维皮肤模型评价修复功能的体外方法，其特征是包括以下步骤：

(1)损伤模型的制备：选取重建正常人体三维皮肤模型，采用十二烷基磺酸钠或机械损伤方法进行造模，制备损伤模型，同时设置对照组；

(2)修复：分别采用无血清培养基或生理盐水、阳性物和受试物对步骤(1)中的损伤模型进行修复，形成损伤组、阳性组和受试物组；

(3)评价指标的测量：测量各实验组的电阻、常规组织学或免疫组织学观察、细胞因子水平、蛋白表达水平和相关基因分析各评价指标中的一种或几种；

(4)结果分析：各评价指标采用单因素方差分析进行统计学分析，α＝0.05，其中两种以上的评价指标升高或降低有统计学差异时，并且两次独立测试获得一致结果时，认为该受试物在分析条件下具有修复功能。

2.根据权利要求1所述的采用重建正常人体三维皮肤模型评价修复功能的体外方法，其特征是：步骤(1)中损伤模型的制备中的给药方式为将十二烷基磺酸钠直接涂抹在体外重建正常人体三维皮肤模型表面制备损伤模型，或采用机械损伤方式对重建正常人体三维皮肤模型表面擦伤、刺伤或划伤制备损伤模型。

3.根据权利要求1所述的采用采用重建正常人体三维皮肤模型评价修复功能的体外方法，其特征是：步骤(1)中采用十二烷基磺酸钠进行造模，制备损伤模型时，十二烷基磺酸钠的质量百分含量为0.1％-10％，暴露时间为5-60min，温度条件为20-25℃，相对湿度为40％-70％。

4.根据权利要求1所述的采用重建正常人体三维皮肤模型评价修复功能的体外方法，其特征是：步骤(1)中所述对照组为无血清培养基或生理盐水，步骤(1)中所述的对照组还包括受试物对照组，所述受试物对照组也为无血清培养基或生理盐水。

5.根据权利要求1所述的采用重建正常人体三维皮肤模型评价修复功能的体外方法，其特征是：步骤(2)中修复时的给药方式为将无血清培养基或生理盐水、阳性物或受试物直接涂抹在损伤模型表面，或采用培养液给药方式，具体是将损伤模型置于含有无血清培养基或生理盐水、阳性物或受试物培养液中进行给药。

6.根据权利要求5所述的采用重建正常人体三维皮肤模型评价修复功能的体外方法，其特征是：直接涂抹时，受试物浓度为10-50mg/μL，涂抹时间为10-60min，涂抹结束后清洗去除受试物，保持重组皮肤模型表面干燥，所述受试物能进行多次涂抹，涂抹时间间隔为6-24h；采用培养液给药时，所述受试物的质量体积浓度不超过100mg/mL，或所述受试物的质量百分含量不超过10％。

7.根据权利要求1所述的采用重建正常人体三维皮肤模型评价修复功能的体外方法，其特征是：步骤(2)中所述的阳性物为对皮肤具有明显促进修复的物质，所述的受试物为植物提取物、动物提取物、中药提取物、化妆品、化妆品原料或化学品。

8.根据权利要求7所述的采用重建正常人体三维皮肤模型评价修复功能的体外方法，其特征是：所述的阳性物为表皮生长因子、胎牛血清、细胞外基质、消炎物质或类固醇激素，所述的受试物为基底膜提取物、壳聚糖、维生素E、海藻糖、脱细胞基质、小分子肽、蛋白多糖或化学制剂。

9.根据权利要求4所述的采用重建正常人体三维皮肤模型评价修复功能的体外方法，其特征是：步骤(2)中采用无血清培养基或生理盐水对步骤(1)中的对照组进行修复；步骤(2)中采用受试物对步骤(1)中的受试物对照组进行修复。

10.根据权利要求1所述的采用重建正常人体三维皮肤模型评价修复功能的体外方法，其特征是：步骤(3)中采用经皮肤电阻仪检测皮肤表面电阻值，采用MTT法或XTT法检测组织活性，采用固定组织进行常规组织学或免疫组织学观察分析，采用ELISA方法进行细胞因子水平分析，采用western blot法进行蛋白表达水平分析，采用PCR法进行相关基因分析；其中常规组织学分析方法包括4％多聚甲醛固定、石蜡包埋和制备组织学切片，切片进行乙醇脱水和二甲苯透明，再进行HE染色，染色的组织学切片在普通生物学显微镜下观察和分析；免疫组织化学方法是采用抗体与对应的皮肤修复相关的特征性标志物进行原位结合反应，通过抗体带有的荧光物质在荧光显微境下观察和分析的方法；与皮肤修复相关的炎症因子为TNF-a,IL-8,IL-1b或EGF-2；与皮肤修复相关的基因为角蛋白K10、角蛋白K14、套膜蛋白(Involucrin,IVL)、Ki-67、谷胺酰转氨酶1(Transglutaminase,TGM1)、兜甲蛋白(Loricrin,LOR)、丝聚蛋白(Filaggrin,FLG)、后胶封蛋白3E(Late cornified envelope3E,LCE3E)、人β防御素2(human beta defensin-2,hBD-2)，管家基因为酸性核糖体磷蛋白P0(human acidic ribosomal phosphoprotein P0,RPLP0)；与皮肤修复相关的细胞外基质为III型胶原蛋白、V型胶原蛋白、弹性蛋白、原纤维蛋白(Fibrillin)、细胞粘合素C(Tenascin)、蛋白聚糖(Versican)或透明质酸。