[发明专利]一种暗纹东方鲀原代肝细胞高效分离及培养方法

说明书

本发明公开了一种暗纹东方鲀原代肝细胞分离及培养方法，包括以下步骤：(1)选取暗纹东方鲀稚鱼，无菌解剖摘取肝脏，清洗，剪碎；(2)将剪碎的肝脏利用胶原酶Ⅱ消化液消化，过滤，离心，沉淀中加入裂解液处理后得细胞悬液，然后加入到分离液中，离心去除杂质；(3)向沉淀中加预温过的完全培养基，混匀，补足完全培养基，进行培养。对于现有技术，本发明暗纹东方鲀原代肝细胞分离及培养方法，能够解决肝细胞分离困难的问题，并且肝细胞分离效率高，培养得到的细胞生长良好，生理状态稳定，符合原代培养要求。

技术领域

本发明涉及一种暗纹东方鲀原代肝细胞高效分离及培养方法，属于暗纹东方鲀原代肝细胞分离及培养技术领域。

背景技术

暗纹东方鲀(Takifugu fasciatus)属于海淡水洄游型鱼类，主要分布于长江中下游地区，为长江三鲜之一。近年来，国家和政府加大了对河鲀养殖产业的支持，暗纹东方鲀养殖技术成熟，产量逐年升高。然而，在产业快速发展的同时，养殖过程中的种种问题也逐渐浮现(如种质资源退化，各种病害频发)。因此，加大对暗纹东方鲀的基础研究力度有利于其养殖业的健康快速发展。然而，在暗纹东方鲀基础研究方面，原代肝细胞的培养仍没有突破。

肝脏作为鱼类最主要的代谢器官，在鱼类的消化吸收、物质代谢、毒素分解和病害防御等生命活动中发挥重要作用。原代培养的肝细胞离体时间短，生物性状尚未发生很大变化，较好的保留及维持了肝细胞的完整性和代谢活性，在一定程度上可以更精准的反应体内代谢情况。然而，根据前期实验，暗纹东方鲀肝脏中的脂肪含量达75％以上，远远超过常规鱼类肝脏中的脂肪含量。肝脏中高密度脂肪的积累，给肝细胞的分离带来了巨大的困难。

发明内容

发明目的：针对上述技术问题，本发明目的提供一种暗纹东方鲀原代肝细胞高效分离及培养方法，该方法对后续在细胞层面开展相关理论研究提供了技术支持。

技术方案：为达到上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

一种暗纹东方鲀原代肝细胞分离及培养方法，包括以下步骤：

(1)选取暗纹东方鲀稚鱼，无菌解剖摘取肝脏，清洗，剪碎；

(2)将剪碎的肝脏利用胶原酶Ⅱ消化液消化，过滤，离心，沉淀中加入裂解液处理后得细胞悬液，然后加入到分离液中，离心去除杂质；

(3)向沉淀中加预温过的完全培养基，混匀，补足完全培养基，进行培养。

作为优选：

步骤(1)中所述暗纹东方鲀稚鱼，是体长为2±0.5cm，体重为2±0.3g的未经饲料转化，用红虫或卤虫饲养的稚鱼，取肝组织前饲养在盐度为1-3的水环境中，饥饿处理。

步骤(2)中所述胶原酶Ⅱ消化液的浓度为0.5-2mg/ml，加入量为每克肝组织加入7-9ml，25-28℃消化1.5-3h。

步骤(2)中所述沉淀中加入红细胞裂解液处理，方法为：在沉淀中加入红细胞裂解液，混匀，离心，得细胞沉淀，向沉淀中加入基础培养基，混匀，得细胞悬液。

步骤(2)中所述分离液为60％percoll分离液，细胞悬液与percoll分离液的体积比为3:(4-6)。

步骤(3)中所述完全培养基成分包括：DMEM基础培养基中加入胎牛血清和暗纹东方鲀血清，DMEM基础培养基、胎牛血清及暗纹东方鲀血清体积比为12-15：4-5：1-3，并且加入包含青霉素和链霉素的双抗溶液和谷氨酰胺溶液，调pH至为7.6～7.8之间。

优选，每100ml完全培养基中加入110μl双抗溶液和0.5～1.5ml L-谷氨酰胺溶液，双抗溶液中含有青霉素100Units/ml和链霉素100μg/ml，谷氨酰胺溶液的浓度为20mmol/L