[发明专利]一种烟草假木贼碱合成调控基因NtERF91的克隆和应用

说明书

本发明公开了烟草假木贼碱合成调控基因NtERF91及其克隆方法与应用，假木贼碱合成调控基因NtERF91核苷酸序列如SEQ ID：No.1所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID：No.2所示。本发明还公开了假木贼碱合成调控基因NtERF91的克隆方法，具体步骤包括：A、确定NtERF91基因序列；B、提取烟草RNA，反转录得到第一链cDNA；C、根据NtERF91基因序列设计合成特异性引物，以cDNA作为模板，进行PCR扩增；D、回收和纯化PCR产物；E、构建了含NtERF91基因的过表达载体。将过表达载体通过农杆菌介导的转化在烟草中过表达，制备转基因植株。结果显示，转基因植株的上部、中部、下部烟叶中假木贼碱含量分别相比对照增加了1.5倍、1.6倍和1.3倍，说明烟草NtERF91基因在培育高假木贼碱含量的烟草方面具有较大的应用前景。

技术领域

本发明属于遗传工程技术领域，具体涉及一种烟草假木贼碱合成调控基因NtERF91的克隆方法与应用。

背景技术

烟草生物碱占烟草总干重的2％-4％。在烟草四种生物碱当中，烟碱占到了总生物碱的95％左右，新烟碱、降烟碱以及假木贼碱仅占剩余的5％。在烟草中，假木贼碱在烟草总生物碱中的比例较低。在自然界当中，这些烟草生物碱类化合物具有生物活性，在烟草防御系统当中作为天然毒素来防御昆虫或食草动物的捕食。

假木贼碱是一种吡啶和哌啶类生物碱，它主要存在于树烟草(Nicotiana glauca)和栽培烟草(Nicotiana tabacum)中。假木贼碱的化学性质与烟碱相似，农业上主要被用作杀虫剂来使用。在药理学上，假木贼碱是乙酰胆碱受体的激动剂。在高剂量下，它可以对神经传导产生去极化阻碍，从而造成烟碱毒害的病症，最终可造成心脏停跳而引发死亡。另外，假木贼碱的过量摄入还会导致动物畸形。

在烟草生物碱次生代谢调控方面，ERF(Ethylene Response Factor)类型的转录因子基因被认为是烟草中调控烟碱合成重要调控因子。调控烟碱合成的NIC2遗传位点已被发现是由至少7个ERF基因组成，如NtERF189，NtERF179等。这些ERF转录因子属于ERF家族中I的X亚族，它们可以通过直接结合烟碱合成途径中关键代谢限速酶基因(如NtPMT、NtQPT)的启动子中的GCC-box来转录激活该基因的表达，进而增强烟碱的合成与积累。然而，假木贼碱作为烟草生物碱当中积累量较少的生物碱，针对调控其代谢和积累的转录调控因子基因尚未见报道，因此亟需填补此项空白。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种烟草假木贼碱合成调控基因NtERF91；第二目的在于提供所述的烟草假木贼碱合成调控基因NtERF91的克隆方法；第三目的在于提供所述的烟草假木贼碱合成调控基因NtERF91的应用。

本发明的第一目的是这样实现的，所述的烟草假木贼碱合成调控基因NtERF91的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

本发明的第二目的是这样实现的，包括以下步骤：

A、确定NtERF91基因序列；

通过分析茉莉素处理烟草根部组织的转录组数据，获得受茉莉素正向调控ERF家族基因1个，序列比对发现该基因为NtERF91。根据该基因序列设计基因克隆引物：

正向引物NtERF91-BamH I：

GGATCCATGTTAACTAGTGTCAATACCACGT；

反向引物NtERF91-Xho I：CTCGAGTCAATTTTCAGCCAATTTTCTCTTC；

B、提取烟草根组织RNA，反转录得到第一链cDNA；