[发明专利]一种生产亚精胺的工程菌

说明书

本发明公开了一种生产亚精胺的工程菌，属于遗传工程领域。本发明采用代谢工程改造的方法，解除亚精胺合成途径的各种产物抑制、改变亚精胺转运系统、强化关键通路的酶活性、并引入外源途径，获得了一株高产亚精胺的大肠杆菌工程菌。具有良好的工业应用前景。

技术领域

本发明涉及一种生产亚精胺的工程，属于生物工程技术领域。

背景技术

亚精胺(Spermidine)，线性分子式为NH₂(CH₂)₃NH(CH₂)₄NH₂，广泛存在于微生物、植物和动物体内，是一种重要的生理活性物质。亚精胺具有延长动物寿命的功效，并抵消与年龄相关的疾病，如心血管疾病，神经退行性疾病和癌症等。

如图1所示，生物体中主要有两条途径合成亚精胺：(1)经由羧基化腺苷甲硫氨酸和腐胺在亚精胺合成酶的作用下直接合成亚精胺，羧基化腺苷甲硫氨酸可由甲硫氨酸(Met)，经过相关酶的腺苷化和脱羧化催化得到，该途径在动物、植物和微生物体内，是比较常见的传统亚精胺合成的途径；(2)经由天冬氨酸-β-半醛和腐胺在羧基亚精胺脱氢酶和脱羧酶的催化下合成亚精胺，天冬氨酸-β-半醛可经常见氨基酸如天冬氨酸(Asp)经相关酶的磷酸化和脱氢化催化合成，该途径为新发现的替代合成途径，主要存在于一些细菌中，包括重要的人类病原体，肠道菌群等。在大肠杆菌中仅存在途径1。这些途径中的酶受到高度调控，动植物体的亚精胺含量较低，目前也未发现可以大量生产亚精胺的微生物。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是构建一种经改造的大肠杆菌基因工程菌，能够实现亚精胺的高效生产。

[技术方案]

本发明提供了一种大肠杆菌基因工程菌，是以大肠杆菌为宿主，敲除了编码DNA结合转录抑制因子的metJ基因、编码DNA结合双转录调节因子的argR基因，并对编码高丝氨酸O-琥珀酰转移酶的metA基因进行突变构建负反馈突变体，以解除甲硫氨酸对高丝氨酸O-琥珀酰转移酶的反馈抑制。

更进一步地，本发明还利用强启动子替代编码甲硫氨酸腺苷基转移酶的基因metK、编码鸟氨酸脱羧酶的基因speC、编码S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶和亚精胺合成酶的基因speDE的天然启动子。例如，利用强启动子trc替代metK、speC、speDE的天然启动子，以强化表达甲硫氨酸腺苷基转移酶、鸟氨酸脱羧酶、S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶、亚精胺合成酶。

更进一步地，本发明还敲除了将亚精胺转移到胞内的转运蛋白PotABCD，并强化了将亚精胺转移到胞外的转运蛋白MdtJI的表达。例如，敲除了转运蛋白的ATP结合亚基potA，并利用强启动子trc替代mdtJ、mdtI的天然启动子，以强化表达大肠杆菌将亚精胺转运出细胞的蛋白。

更进一步地，本发明还进一步敲除了编码二氨基庚酸脱羧酶的lysA基因，或者，在敲除了lysA基因的基础上进一步敲除编码高丝氨酸激酶和苏氨酸合成酶的thrB和thrC基因，或者，在敲除了lysA、thrB和thrC基因的基础上进一步敲除编码吡咯啉-5-羧酸还原酶的proC基因。

更进一步地，本发明还进一步敲除了编码谷氨酸-腐胺连接酶的puuA基因。

更进一步地，本发明还进一步引入外源的合成亚精胺的途径。例如，本发明还进一步表达了外源的羧基亚精胺脱氢酶基因、外源羧基亚精胺脱羧酶基因。

本发明提供的基因工程菌可以用于生产亚精胺，尤其是用于高密度培养生产亚精胺。

本发明的基因工程菌可以选择的宿主包括大肠杆菌BL21(DE3)、大肠杆菌JM109、大肠杆菌DH5α、大肠杆菌Top10或大肠杆菌MG1655。