[发明专利]一种输卵管上皮细胞的纯化培养体系

说明书

本发明公开了一种输卵管上皮细胞的纯化培养体系，包括上皮细胞促贴壁试剂和完全培养基，所述上皮细胞促贴壁试剂由人类间充质干细胞促贴壁试剂与1640基础培养基以1:99的体积比混合而成；所述完全培养基包括：上皮细胞无血清培养基、Ultra GROTM–Advanced、谷胱苷肽、乳糖醛酸、左氧氟沙星。本发明选用了上皮细胞无血清培养基和人上皮细胞促贴壁试剂联合使用，进一步的限制的内皮细胞和纤维细胞的贴壁，起到了细胞纯化作用；此外，还添加了1～2％谷胱苷肽和5～15％乳糖醛酸，避免了细胞在体外培养过程中出现分化，使得人输卵管上皮细胞这类型较为成熟的细胞能够保持原有的性质，迅速分裂增殖，细胞纯度高，质量均一，数量充足。

技术领域

本发明涉及一种生物培养技术，具体是一种输卵管上皮细胞的纯化培养体系。

背景技术

胚胎早期发育过程在输卵管中进行，与输卵管微环境相互作用，并按其特定的程序逐渐发生。因此输卵管在人类生殖过程中占有重要的地位。输卵管上皮细胞的形态及功能研究已成为生殖医学领域的一个研究热点，但对妊娠早期输卵管的功能的研究尚不完全，在体外的研究又受到较大的限制，而输卵管上皮细胞体外培养是一种理想的研究模型。

目前，输卵管上皮细胞的组织来源多为输卵管伞部组织，常用方法为机械剪取和酶消化法获取上皮细胞，同时结合自然沉降差速贴壁法来初步纯化细胞，该细胞群含有多种类型的细胞：成纤维细胞、间质细胞。因此，该操作步骤仍不可避免混入部分人纤维细胞，所获得的细胞纯度低，不利于“目标”细胞的后续纯化。现有的输卵管细胞分离后，直接接种，细胞团中含有大量的红细胞，影响目标细胞的贴壁。此外，输卵管上皮细胞在体外培养P3-P5代时，细胞便出现包浆空泡及颗粒状物质增多等分化现象，随着细胞培养代次的增加，成纤维细胞的增殖优势明显，所获得的细胞群中含有大量的纤维细胞，从而导致输卵管上皮细胞培养失败。因此，需进一步的改进输卵管上皮细胞的培养体系，利于细胞纯化和大规模扩增；故需要开发出一种新型的培养体系，仅适用于输卵管上皮细胞的生长，迫在眉睫。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种输卵管上皮细胞的纯化培养体系。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种输卵管上皮细胞的纯化培养体系，包括上皮细胞促贴壁试剂和完全培养基，所述上皮细胞促贴壁试剂由人类间充质干细胞促贴壁试剂与1640基础培养基以1:99的体积比混合而成；所述完全培养基包括：上皮细胞无血清培养基、Ultra GROTM–Advanced、谷胱苷肽、乳糖醛酸、左氧氟沙星，其中上皮细胞促贴壁试剂与完全培养基的体积比为1:2。

优选地，所述Ultra GROTM–Advanced的浓度为5～10％、谷胱苷肽的浓度为1～2％、乳糖醛酸的浓度为5～15％、左氧氟沙星的浓度为1×。

本发明还提供了一种输卵管上皮细胞的纯化培养方法，包括以下步骤：

(1)取宫外孕病人的正常输卵管组织，将剪开的输卵管内膜放入含有碱性磷酸酶和胶原酶Ι的消化液进行消化；

(2)在上述消化液中加入浓度为10％的血清，离心，弃上清，再用含血清的培养液漂洗离心收集的细胞；

(3)在上述细胞中加入所述输卵管上皮细胞的纯化培养体系制成细胞悬液，调整细胞浓度并接种于培养瓶中，置于37℃、5％CO₂的恒温箱中培养，每3～4天换一次培养液。

(4)采用免疫荧光检测获得的输卵管上皮细胞细的标志物胞角蛋白-17(CK-17)。

优选地，所述步骤(2)中消化液中碱性磷酸酶和胶原酶Ι的浓度分别为0.25％和0.125％。

优选地，所述步骤(2)中消化液消化的温度为37℃，消化时间为0.5小时。

优选地，所述步骤(3)中细胞浓度为1×10⁵个/mL。