[发明专利]一种改善体外成熟猪卵母细胞质量的方法

说明书

本发明公开了一种改善体外成熟猪卵母细胞质量的方法，在玻璃化冷冻前采用甲基‑β‑环糊精预处理猪GV期卵母细胞。优选的，甲基‑β‑环糊精的浓度为3～8mg/mL，预处理的时间为5～6.5min。本发明直接采用甲基‑β‑环糊精处理未成熟的卵丘‑卵母细胞复合体，然后再进行玻璃化冷冻，解冻后再进行体外成熟培养，发现在玻璃化冷冻之前添加外源性胆固醇增强了在GV期玻璃化冷冻后体外成熟的猪卵母细胞的质量，有利于猪卵母细胞的长期保存。

技术领域

本发明涉及一种改善体外成熟猪卵母细胞质量的方法。

背景技术

动物卵母细胞广泛用于体外胚胎生产、核移植和基因库保存等过程中，因此，研究人员对卵母细胞冷冻保存的多个领域产生了相当大的兴趣。在过去的20年里，猪卵母细胞的保存一直受到阻碍。近年来，已经进行了多次冷冻保存猪卵母细胞的尝试，结果不同。猪卵母细胞的成功冷冻保存对遗传资源的保护和辅助生殖技术具有重要意义。尽管猪卵母细胞对低温高度敏感，但近年来玻璃化冷冻技术的发展改善了结果。Somfai的研究显示从冷冻保存的GV期卵母细胞中成功生产仔猪。Gajda的研究则显示从冷冻保存的MII期卵母细胞中成功生产仔猪。虽然玻璃化冷冻GV期猪卵母细胞可以产生后代，但胚胎发育的速度仍然很低Appeltant等。因此，必须继续努力优化玻璃化冷冻过程。

在哺乳动物卵母细胞的冷冻保存期间，冷冻保存损伤的一个重要部位是细胞质膜，尤其是膜中的脂质。降低温度导致脂质经历从液晶相到凝胶相的转变(脂质相转变)，这可导致膜完整性降低和细胞死亡。在这方面，膜胆固醇：磷脂(C：P)比率是冷冻保存过程中膜流动性和稳定性的重要决定因素。具有高胆固醇浓度的膜(高胆固醇膜：磷脂比)在较低温度下更具流动性，因此对冷冻不敏感。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术中猪卵母细胞冷冻后存活率较低的缺陷，提供一种改善体外成熟猪卵母细胞质量的方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：

一种改善体外成熟猪卵母细胞质量的方法，在玻璃化冷冻前采用甲基-β-环糊精预处理猪GV期卵母细胞。

进一步的，甲基-β-环糊精的浓度为3～8mg/mL。优选的，甲基-β-环糊精的浓度为5mg/mL.

进一步的，预处理的时间为5～6.5min。

本发明所达到的有益效果是：本发明直接采用甲基-β-环糊精处理未成熟的卵丘-卵母细胞复合体，然后再进行玻璃化冷冻，解冻后再进行体外成熟培养，发现在玻璃化冷冻之前添加外源性胆固醇增强了在GV期玻璃化冷冻后体外成熟的猪卵母细胞的质量，有利于猪卵母细胞的长期保存。

具体实施方式

以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例

1.1相关溶液的制备

玻璃化冷冻和解冻溶液的基本培养基是具有20％FBS的HEPES缓冲的TCM199。在基本培养基中补充不同浓度(0,0.5,5和10mg/mL)的CLC。平衡溶液由7.5％乙二醇(EG)、7.5％二甲基亚砜(DMSO)和含20％FBS的TCM199组成。玻璃化溶液由含有15％EG、15％DMSO、20％FBS、0.4M蔗糖的TCM199组成。解冻I液：在含有20％FBS的TCM199中加入0.5m蔗糖，解冻II液由含有20％FBS的TCM199中的0.25M蔗糖组成。孵育液为含10％FBS的TCM199。