[发明专利]一种多靶点抗血栓活性物质的液相色谱-质谱筛选方法

说明书

本发明公开了一种基于干血斑样本的多靶点抗血栓物质的液相色谱‑质谱筛选方法，属于药物筛选领域。所述方法包括以下步骤：再水化干血斑样本，任选几种血栓形成过程涉及的关键靶酶的底物，将几种底物标准溶液与待筛选物质混合后加入到所述再水化的干血斑样本中，反应溶液处理后进行液相色谱‑质谱联用分析以筛选得到具有多靶点抗血栓活性的物质。本发明的筛选方法操作简单快捷、准确性高、特异性强，可连续分析大量的样品，该筛选方法能同时筛选出对一个或者几个靶酶同时抑制的抗血栓物质，且筛选出的活性物质作用靶点明确，为后续的药物开发奠定了理论基础。使用试剂易于获得，操作自动化程度高，易于临床推广及普及，商业化价值高。

技术领域

本发明涉及药物筛选领域，具体而言，涉及一种基于干血斑样本的多靶点抗血栓活性物质的液相色谱-质谱筛选方法。

背景技术

据报道，中风、冠心病等血栓性疾病已成为威胁人类健康的主要杀手。研究显示，血小板异常激活导致血小板聚集以及一系列凝血因子相继被激活使纤维蛋白原转化为纤维蛋白，之后结成网并网罗红细胞使血栓团块迅速增大，最终与血小板紧密结合形成一个牢固血栓，这是引起动脉血栓性疾病和静脉血栓性疾病的主要原因。从血栓形成机制来看，多种酶和受体都参与了血栓形成过程。理论上讲，其中的任何一种酶、受体或者其组合都可作为抗血栓药物的作用靶点。目前研究较多的有凝血酶、凝血因子IXa、凝血因子Xa、凝血因子XIa、凝血因子XIIa、磷酸二酯酶、磷脂酶A₂、环氧合酶、二磷酸腺苷受体、血栓素A₂合成酶、血小板糖蛋白受体、维生素K环氧化还原酶、磷脂酰肌醇3-激酶等。

以酶和受体为靶点的抗血栓药物很多，包括以环氧化酶为靶点的抑制剂，如阿司匹林、磺吡酮等；P2Y₁₂受体拮抗剂，如氯吡格雷等；磷酸二酯酶抑制剂，如双嘧达莫等；血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa(GPⅡb/Ⅲa)受体拮抗剂，如依替巴肽和替罗非班等；以及参与凝血过程的一系列凝血因子的抑制剂，如凝血酶抑制剂阿加曲班、凝血因子Xa抑制剂利伐沙班等。但是，上述药物均为单靶向药物，抑制单个靶点忽视了人体作为一个系统所具有的复杂性和稳健性，用药时容易因单个靶点发生突变导致药物失效；同时，药物与靶点之间高度亲和，使细胞正常的生理功能受到影响，从而可能导致严重的毒副作用。而多靶点药物可针对疾病网络系统中的多个靶点，同时调节疾病网络中的多个环节，从而达到增加疗效、降低毒副作用的临床效果，所以多靶点药物成为研究的热点，并已应用于很多复杂疾病的治疗(KnoxSS.等,Cancer Cell International,2010.10:11-24.)。为配合多靶点药物的研究，目前亟需建立能够快速、高通量筛选多靶点药物的方法。

已有少量文献报道了双靶点抑制剂筛选的方法，使用的方法包括气相色谱-质谱、液相色谱-基质辅助激光解吸电离质谱、电感耦合等离子体质谱、常压质谱以及毛细管电泳技术。

例如，Li等开发了基于双酶共固定化毛细管微反应器的毛细管电泳方法，用于同时筛选腺苷脱氨酶和黄嘌呤氧化酶抑制剂(Li P.等,Journal of Separation Science.,2013.36:2538-2543.)。但是该方法只报道了双靶点抑制剂的筛选，并未涉及对多靶点的抑制剂的筛选。而且，该方法使用商品化的靶酶，酶反应体系中需要使用缓冲盐以维持商品化酶源的活性。而在线酶反应器毛细管电泳技术需要在入口端固定化毛细管微反应器，毛细管微反应器不适用于孵育缓冲液和分离缓冲液不同的酶反应系统。另外，固定化酶微反应器的制备复杂，不同的固定化方式法存在不同缺陷，这使得毛细管电泳技术不适用于多酶抑制剂的同时筛选。