[发明专利]一种杜仲悬浮细胞超低温保存方法

说明书

本发明涉及一种杜仲悬浮细胞超低温保存方法，该方法包括以下步骤：（1）建立细胞悬浮培养系；（2）预培养：将悬浮细胞接种到预培养基中4~6℃培养5d；（3）预处理：将悬浮细胞先后用预冷的玻璃化液、冷冻保护剂处理；（4）冷冻保存：悬浮细胞加入预冷的冷冻保护剂直接投入液氮保存；（5）化冻和洗涤：40℃水浴化冻，再重复洗涤3~5次；（6）恢复培养。本方法针对杜仲悬浮细胞特性，摸索出了合适的预培养基和冷冻保护剂，并对整个技术流程进行优化，应用本发明的方法保存的杜仲悬浮细胞，其成活率可达88%以上，并且所需设备简单，处理步骤方便，重复性好，细胞保存长期安全稳定，成本较低。

技术领域

本发明涉及一种杜仲悬浮细胞超低温保存方法，属于药用植物细胞保存技术领域。

背景技术

杜仲（Eucommia ulmoides Oliv.）又名思仲、思仙等，为杜仲科杜仲属多年生落叶乔木，树高可达20米，胸径约50厘米，是我国特有的名贵经济树种。杜仲喜温暖而凉爽的气候，属喜光树种，在强光、全光条件下才能良好生长，适应性较强，对土壤没有严格选择，但以土层深厚、疏松肥沃、湿润、排水良好的壤土最宜。杜仲树的生长速度在幼年期较缓慢，速生期出现于7~20年，20年后生长速度又逐年降低，50年后，树高生长基本停止，植株自然枯萎。杜仲在我国有丰富的资源，其天然分布中心在秦岭以南山地，四川、贵州、湖北、湖南、陕西、甘肃、云南、广西、广东、河南、浙江、安徽、江西等省均有分布。杜仲是一种名贵药用植物，其性味甘、微辛、温、无毒，久服能轻身耐老，延年益寿，是著名的补益类抗衰老中药。《神农本草经》记载：“杜仲，又名思仙、木绵、思仲、玉丝皮等，主腰脊痛，补中益精气，坚筋骨，强志，除阴下痒湿、小便余沥”；《名医别录》记载：“杜仲性温味甘，补肝肾、强筋骨”；《本草正》记载：“止小水梦遗、暖子宫、安胎气”。历版《中国药典》均收载杜仲皮作为药材，具有补肾、健腰、强筋、壮骨、安胎、降压等功效。但据新的研究表明，杜仲的花、叶、果实、枝条中也含有与皮类似的有效成分。这些有效成分主要包括木脂素类、环烯醚萜类、黄酮类、苯丙烷类、多糖、酚类、三萜类、甾类等，其药理作用主要表现在提高机体缺氧耐力、改善提高机体免疫功能、降血脂、降血压、抗骨质疏松症、抗肿瘤、护肝、降血糖、抗衰老等。

近年来由于人们对药用植物需求的增加以及过度开发，杜仲野生植物资源已面临枯竭，并被列入了《中国植物红皮书——稀有濒危植物》。目前药用杜仲大多是人工栽培，尽管如此，但由于杜仲生长周期长，生长速度慢，一般需生长15~20年以上才能剥皮药用，药材资源仍然供不应求。科学研究表明，许多药用植物的药理作用与其所含的次生代谢产物有关。运用细胞工程生产有用次生代谢产物是目前全世界生物技术研究的三大潮流之一。利用药用植物悬浮细胞培养代替栽培植物具有许多优越性，如不受地理、气候和季节的限制；不受病虫害的侵袭；节约土地；能在人工控制的条件下生产所需产物；对于生长周期长的植物，利用细胞培养则可在短期内生产出目标产物等。筛选高产细胞系是实现药用植物悬浮细胞大规模工业化生产的关键，但在悬浮细胞的不断继代过程中，容易出现积累性遗传变异，导致细胞生长缓慢、目标产物合成能力降低等问题。而建立一种保存方法将优良细胞系长期稳定地保存起来是解决上述问题的一个重要途径。

超低温保存是长期保存植物组织和细胞并保持其遗传稳定性的有效方法。超低温保存是指将植物的活细胞、组织或器官置于液氮（-196℃）条件下的保存方法，在此温度下，调节和控制细胞生长代谢的各类酶的作用受到极大抑制，新陈代谢活动基本停止，处于“生机停顿”或“假死”状态。经过超低温保存后，处于“假死”状态的植物材料能保持正常细胞的活性、形态发生潜能和遗传稳定性，从而达到长期保存植物材料的目的，理论上可以无限期保存种质资源。依据不同原理可将超低温保存方法分为两类：一类是依据冷冻脱水的原理，结合程序降温的传统保存技术；另一类是依据植物细胞玻璃化原理，采取快速降温方式的新技术。传统技术主要为两步降温法，另外还有慢速降温法和逐级降温法等，传统技术需要程序降温仪或连续降温冰冻装置等昂贵的仪器设备来控制降温速度，成本较高，操作较为繁琐。