[发明专利]细叶百合耐盐基因LpNAC20的克隆及其应用

说明书

本发明涉及细叶百合(Lilium pumilum DC.)耐盐基因LpNAC20的克隆及其应用。包括以下步骤：(1)目的基因的克隆；(2)表达载体的构建；(3)转基因植株生理指标的检测。本项实验以细叶百合为研究对象，应用RT‑PCR技术克隆LpNAC20基因；通过构建过表达载体转化烟草；通过转基因烟草鉴定LpNAC20的过表达提高烟草盐胁迫的功能，揭示细叶百合NAC基因在受到逆境胁迫时有何功能，为细叶百合在百合育种的进一步应用奠定基础，为NAC转录因子的功能和作用提供理论依据。

技术领域

本发明涉及基因技术领域，尤其涉及一种细叶百合耐盐基因LpNAC20及其应用。特别涉及一种细叶百合LpNAC20基因的克隆、表达载体的构建、烟草的转化，以及所述基因在提高转基因植物盐胁迫抗性的应用。

背景技术

NAC转录因子是植物中一类非常重要的转录因子，参与植物生长发育、生物与非生物胁迫、激素信号传导通路和光信号通路等多种反应。不少研究已经证实NAC转录因子在植物发育和生长调节以及逆境应答分子网络中扮演着极其重要的角色，目前已发现多个NAC蛋白参与植物对逆境的响应。

细叶百合(Lilium pumilum DC.)又名山丹，为百合科百合属多年生草本植物。细叶百合在食用、药用、观赏方面都有一定的应用价值，在园林应用方面其观赏价值尤为突出。同时细叶百合抗盐性很强，是优良的百合属种质资源，可用于培育抗盐的百合新品种。

本项实验以细叶百合为研究对象，应用RT-PCR技术克隆LpNAC20基因；通过构建过表达载体转化烟草；通过转基因烟草鉴定LpNAC20的过表达植株抵抗盐胁迫的功能，为细叶百合在百合育种的进一步应用奠定基础，为NAC转录因子的功能和作用提供理论依据。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种细叶百合耐盐基因，并验证其功能。

为了实现上述任务，本发明采取如下技术解决方案：

一种细叶百合耐盐基因，其特征在于，该细叶百合耐盐基因含ORF开放阅读框的部分核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，长度为1986bp；其cDNA编码氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示，编码661个氨基酸。

与现有技术相比，本发明的细叶百合耐盐基因，带来的有一技术效果在于：

1、得到了细叶百合耐盐基因含ORF开放阅读框的部分核苷酸序列。

2、根据申请人的实验证明，将该细叶百合LpNAC20基因转入烟草中，能够明显提高烟草的耐盐能力，可用于提高转基因植物的盐胁迫抗性。

培育得到抗盐能力强的烟草品种，通过以下步骤得以实现：

1)将细叶百合耐盐基因和植物表达载体pBI121-GFP用T4连接酶连接，构建过表达载体；

2)将构建的过表达载体质粒导入农杆菌EHA105，利用农杆菌介导法将LpNAC20基因转入烟草植株，利用卡那霉素筛选阳性植株，采集阳性植株叶片提取DNA和RNA进行分子水平鉴定；

3)将所筛选得到的烟草株系的种子和野生型烟草种子后接种于1/2MS培养基中，通过炼苗，移栽入土中，选取大小基本一致的烟草植株，进行300mmol/L的NaCl盐胁迫处理，观察植物的生长状态， 15d后拍照并剪取相同部位的健康叶片并测定其生理指标。

附图说明

图1细叶百合鳞茎RNA提取电泳结果图；

图2细叶百合LpNAC20基因编码区序列验证电泳图；A：PCR结果；B：转入大肠杆菌后菌液PCR；

图3细叶百合LpNAC20基因中间载体验证电泳图；A:连接pMD18-T中间载体；B:中间载体pMD18-T 双酶切；