[发明专利]一种无血清制备牛支原体抗原的方法

说明书

本发明提供一种无血清制备牛支原体抗原的方法，包括以下步骤：(1)将新鲜的SPF种蛋孵化，培养7‑8天，挑选出健康鸡胚；(2)准备牛支原体接种液；(3)将牛支原体接种液接种选取的健康7‑8日龄SPF鸡胚，接种后，置于孵化箱中继续培养，观察鸡胚状态，收集接种死亡鸡胚，2‑8℃放置12‑24h；(4)无菌收集死亡鸡胚尿囊液，得到牛支原体无血清抗原。本发明可实现牛支原体抗原的无血清生产，避免动物血清使用带来的诸多问题，培养抗原活菌滴度高。

技术领域

本发明涉及一种无血清制备牛支原体抗原的方法。

背景技术

牛支原体病是一种严重危害世界养牛业的动物疫病。该病由牛支原体(Mycoplasma bovis，M.bovis)引起，临床主要表现为犊牛肺炎、关节炎、奶牛乳腺炎等。该病目前在全世界范围内流行，引起重大经济损失。抗菌素治疗和疫苗免疫是预防及控制牛支原体病的重要手段。近年来，越来越多耐药菌株出现给牛支原体病的防控带来严重挑战。

抗原生产是疫苗制备和影响疫苗质量的关键环节。目前牛支原体抗原生产培养主要使用牛支原体液体培养基，如改良KM2培养基、牛心汤培养基、改良Thiaucourt’s培养基等。现有技术牛支原体培养依赖动物血清，培养基中均含有一定比例的动物血清如马血清或猪血清等，血清含量一般在5％-20％之间。血清成分复杂及批次间的差异影响疫苗质量控制，血清易受支原体等微生物污染，后期需要纯化工艺去除血清复杂成分，含血清抗原易增加对牛体的副反应影响免疫效果，此外血清的使用增加了制苗成本。牛支原体疫苗生产中使用血清存在诸多问题，低血清或无血清制备牛支原体抗原是一个重要发展方向。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术制备牛支原体抗原使用动物血清所存在的诸多问题，提供一种可克服现有技术不足的无血清制备牛支原体抗原的方法。本发明方法应用鸡胚培养生产牛支原体抗原，实现牛支原体抗原无血清生产，可克服血清使用带来的诸多问题，培养滴度高，降低了生产成本。

本发明提供一种无血清制备牛支原体抗原的方法，包括以下步骤：

(1)将新鲜的SPF种蛋孵化，培养7-8天，挑选出发育良好、血管清晰、活力旺盛的健康鸡胚；

(2)准备牛支原体接种液；

(3)将牛支原体接种液接种选取的健康7-8日龄SPF鸡胚，接种后，置于孵化箱中继续培养，观察鸡胚状态，收集接种死亡鸡胚，2-8℃放置12-24h；

(4)无菌收集死亡鸡胚尿囊液，得到牛支原体无血清抗原。

作为优选，步骤(1)和步骤(2)的顺序互调。

作为优选，步骤(2)中，所述准备牛支原体接种液的具体方法为：复苏并传代牛支原体菌株，37℃恒温培养箱培养18-36h，待培养基的颜色变黄或pH值由7.4降至6.8-7.0时，离心，生理盐水重悬菌体，得到牛支原体接种液。

作为优选，步骤(3)中，所述接种为卵黄囊接种，接种量为每枚鸡胚接种0.2ml。

作为优选，步骤(3)中，所述孵化箱温度37.0～37.5℃，湿度为50％。

作为优选，步骤(4)后，还包括将收集的鸡胚尿囊液接种7-8日龄健康SPF鸡胚，用相同的方法接种传代3-5次，无菌收集鸡胚尿囊液的步骤。

本发明还提供上述一种无血清制备牛支原体抗原的方法在牛支原体培养中的应用。

本发明还提供上述一种无血清制备牛支原体抗原的方法在牛支原体疫苗抗原制备中的应用。