[发明专利]一种采用串联纳米孔结构的循环肿瘤DNA辨识装置及方法

说明书

本发明涉及一种采用串联纳米孔结构的循环肿瘤DNA辨识装置及方法，所述辨识装置包括电源、Ag/AgCl银电极以及电解质溶液，所述电解质溶液内设有串联纳米孔装置，所述串联纳米孔装置包括两个纳米孔，所述两个纳米孔之间设有空腔；所述电源负极通过导线与Ag/AgCl银电极相连，Ag/AgCl银电极插入电解质溶液中，所述电源正极通过导线与Ag/AgCl银电极相连，电解质溶液中的离子聚集到Ag/AgCl银电极上形成阳极；DNA分子在电场作用下通过纳米孔‑空腔‑纳米孔组成的流道，并在两个纳米孔中都产生离子电流阻塞信号，利用DNA长度与串联纳米孔通道长度的尺寸差，能够实现不同长度DNA的定位。

技术领域

本发明涉及一种采用串联纳米孔结构的循环肿瘤DNA辨识装置及方法，属于生物分子检测技术领域。

背景技术

癌症是威胁人类健康的常见病，是人类三大疾病之一，占全部死亡人数的四分之一。癌症的早期诊断与治疗依然是一项世界性难题。为了洞悉癌症的发生机制，开拓癌症的诊断和治疗方法，精准肿瘤学的焦点愈发转向液体活检。液体活检是一种全面而精准的基因分析技术，主要依靠提取身体循环系统，如外周血、尿液、脑脊液等液体中的标志物来获得疾病信息，相比传统技术克服了取材困难、肿瘤异质性等难题，而且它不具侵袭性，创伤小，可以持续跟踪观测病情变化，为临床肿瘤早期筛查和个体化治疗提供新的方法。

ctDNA (Circulating tumor DNA, 循环肿瘤细胞)是目前在临床中应用最多的液体活检标志物。肿瘤细胞的凋亡，会导致细胞中的DNA进入到人体的循环系统之中，而携带有驱动肿瘤基因突变产生与进化信息（包括异常突变、甲基化、拷贝数异常等）的ctDNA,也会被细胞释放到人体血液当中。通过对患者血液中ctDNA含量的测量，可以实现对患者癌症阶段的判断与肿瘤药物治疗效果的检测，是未来对癌症患者进行“精准医疗”的有效手段。

然而，ctDNA在人体血液样本中的含量极少。由于正常的细胞也会存在凋亡现象，ctDNA在血液中所有循环DNA（cfDNA）中的比例不超过5%。如何从cfDNA中精准检测出ctDNA，仍然是有待克服的难题。目前检测ctDNA的方法主要是通过区分DNA的长度来实现，由于DNA的长度分布很广(1-1000bp),而ctDNA多集中于167bp长度附近,通过定位出167bp左右长度的DNA分子，就可以得到ctDNA用于检测分析。

纳米孔技术作为第三代基因测序技术，是辨识ctDNA的理想方案。如下图所示，把纳米孔并入能分离两个充满盐溶液的液池中，在纳米孔膜两端电极施加电压时，可以产生一个恒定的基准离子电流，当带电分子通过时，由于带电分子在纳米孔中占位，会产生离子电流的变化，事件信号的波形与生物分子的物理信息直接相关，通过分析离子电流变化的信号的幅度、持续时间，就有可能辨识相应分子。当DNA分子受到电场驱动通过单层纳米孔，会由于体积占位产生离子电流阻塞信号，通过膜片钳技术能够精准捕捉到DNA分子的过孔事件，从而统计样本中的DNA数量。纳米孔技术近年来发展迅猛，已取得巨大的进展。在生物分子通过纳米孔的检测方面，科研人员已经运用纳米孔技术检测出了DNA分子、RNA分子以及一些蛋白质分子的过孔信号，其原理在于不同分子引起的堵塞信号不同。

然而，由于膜片钳的采样频率有限，DNA过孔速度极快，通过过孔时间来准确区分DNA分子的长度显然难以实现。所以，通过单个纳米孔精准定位出ctDNA分子存在一定困难。根据理论分析，一个分子越长，其过孔时所引起的占位时间也应该越长，但是实际情况是不同的DNA分子其过孔时间很难区别，特别是当两个DNA长度接近时，因为DNA的过孔速度太快，细节信号很难采集。其次，纳米孔作为单分子（如DNA、RNA或蛋白质）的通用传感器可分为固态纳米孔和生物纳米孔。与生物纳米孔相比，制备的固体纳米孔具有稳定性高、几何形状可调、表面性能好、集成器件潜力大等明显优势，但是噪声信号问题一直很难解决。低频噪声与组成通道壁的聚合物亚基的运动以及纳米孔内存在纳米级气泡有关，不同的DNA分子通过单纳米孔通道时存在噪音信号，细节信号区分不清楚，区分率较低，也会影响ctDNA的区分和检测。综合以上两个原因，用单个纳米孔直接测量DNA长度的方案是难以实现的。

发明内容