[发明专利]黑素细胞冻存液

说明书

本发明提供一种黑素细胞冻存液，所述冻存液包含细胞培养液、胎牛血清、二甲基亚砜和N‑苯基硫脲。本发明提供的黑素细胞冻存液，安全稳定，可重复性好，并且黑素细胞在冻存和复苏后，形态较好，存活率高，增殖能力好，黑素细胞合成黑素颗粒的能力不受影响。

技术领域

本发明属于细胞及生物工程技术领域，具体涉及一种黑素细胞冻存液。

背景技术

黑素细胞位于表皮的基底层，是合成和分泌黑素的树枝状细胞，在成人表皮基底层中的黑素细胞总数约为亿，平均为约占表皮细胞总数3%~5%。正常情况下，黑素细胞增殖能力很弱，体外培养的黑素细胞生长缓慢，容易被成纤维细胞或角质形成细胞的优势生长所掩盖。而且原代黑素细胞老化较快，因此黑素细胞原代培养冻存对于黑素细胞的质量起着非常重要的作用。

细胞冻存液是细胞冻存时必须的一种溶液。目前细胞的常温保存技术并不成熟，细胞保存广泛采用低温冷冻的保存方式。细胞的低温保存需要添加冷冻保护剂，以减少细胞冻存过程中冰晶对细胞造成的物理性损伤。冷冻保护剂有两类：渗透型冷冻保护剂和非渗透型冷冻保护剂。其中渗透型冷冻保护剂能够穿过细胞膜渗透到细胞内，是细胞冻存所必须的，其中最常用的就是二甲基亚砜（DMSO）。

由于黑素细胞的难获取以及国内培养黑素细胞的单位较少，黑素细胞的冻存还没有形成标准的冻存体系，目前对于黑素细胞的冻存还是采用广谱的细胞冻存方法：小牛血清/胎牛血清90% + 二甲基亚砜10%。

大量的实际生物细胞学实验和大量统计数据表明，采用这种冻存液所冻存的黑素细胞复苏后存活率一般在30-50％，成活率比较低。冻存细胞经过复苏，培养12小时后在普通光学显微镜下观察，存活率一般在50％左右；当存活率小于30％时，细胞生长繁殖缓慢，细胞树突形成缓慢，形态不规则，细胞比较细小，长势比较差，恢复时间较长；当细胞存活率在50％左右时，细胞分布比较均匀，活细胞比较多，形态比较正常，长满单层需要4-7天。

因此，在细胞及生物工程技术领域，存在能够克服现有黑素细胞冻存液使得黑素细胞复苏后培养后细胞存活率下降，影响黑素细胞活力的黑素细胞冻存液的强烈需求。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种能够提高黑素细胞复苏后培养后的细胞存活率，提高黑素细胞活力的黑素细胞冻存液。

为此，本发明提供了以下技术方案。

第一方面，本发明提供了一种黑素细胞冻存液，其中，所述冻存液包含细胞培养液、胎牛血清、二甲基亚砜和N-苯基硫脲。

在优选的实施方式中，其中，每1L所述冻存液中包含500-800mL的细胞培养液，例如，每1L所述冻存液中可以包含500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790或800mL的细胞培养液。

在更优选的实施方式中，每1L所述冻存液中包含600-750mL的细胞培养液，例如，每1L所述冻存液中可以包含600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740或750mL的细胞培养液。

在优选的实施方式中，所述细胞培养液采用黑素细胞的培养液。

在更优选的实施方式中，所述黑素细胞的培养液可以为Medium 254或MelM-2。

在优选的实施方式中，每1L所述冻存液中包含100-200mL的胎牛血清，例如，每1L所述冻存液中可以包含100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200mL的胎牛血清。