[发明专利]一种超低温冷冻及封闭式保存方法

说明书

本发明提供一种超低温冷冻及封闭式保存方法，其包括如下步骤：1)提供一具有开口的无菌容器；2)将所述无菌容器置于初始冷源中，且所述无菌容器开口的高度高于所述初始冷源的液面层；3)在所述无菌容器中形成液化气体，作为无菌制冷剂；4)将承载在载体上的待冷冻样品置于所述无菌制冷剂中进行玻璃化冷冻；5)密封所述无菌容器，并将所述密封无菌容器与密封在其中的玻璃化冷冻样品一起超低温保存。

技术领域

本发明涉及生物样品保存领域，尤其涉及一种超低温冷冻及封闭式保存方法。

背景技术

医学、生命科学(包括辅助生殖)、食品、化工等领域均需要用到超低温保存。超低温保存需要使用冷源，冷源包括但不限于液氮等常规制冷剂。

以人辅助生殖领域为例，该领域需要进行胚胎、卵子等细胞样本的冷冻保存，液氮是主要的冷源。玻璃化冷冻因为降温速率快(20,000℃/min以上)、复苏存活率高(≥95％)成为目前人胚胎和卵子冷冻的主要方法。然而，玻璃化冷冻技术潜在的污染风险一直困扰着辅助生殖从业人员。在玻璃化冷冻过程中，需要将装载在冷冻载杆上的胚胎样本与液氮等冷源直接接触。这是因为，只有直接接触液氮才能达到超快速降温，从而保证复苏存活率。而市售液氮等冷源在生产、运输以及液氮罐等其他储存罐内长期保存等环节均有可能被细菌、病毒、真菌等病原微生物污染。致病微生物可以耐受低温并在复苏后具有污染和交叉感染风险，所以开放式玻璃化冻存的胚胎具有潜在的污染风险。为了避免污染或交叉污染，封闭式拉细麦管(CPS，closed pulled straws)、麦管套麦管(straw-in-straw)和Rapid-i等封闭式玻璃化冷冻方法被应用于辅助生殖临床，但存活率欠佳，未能广泛使用。CPS、麦管套麦管和Rapid-i等封闭式玻璃化冷冻方法均是将装载胚胎的冷冻载体插入外套管封闭后再投入液氮实现样本冻结，降温速率慢(仅约2,000℃/min左右)，导致解冻存活率低。

中国专利(申请号201720870512.2)提供一种在液氮工厂生产无菌液氮的设备和方法。虽然生产的液氮无菌，但液氮在运输、储存和使用过程中维持无菌的状态极其困难。而且，细菌或病毒感染患者的胚胎还可能在液氮罐内间接将病原传递给其他“健康”胚胎，导致胚胎发生交叉感染。

因此，亟需一种既能快速降温，又能避免冷源对样品污染的保存方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种超低温冷冻及封闭式保存方法，其能够按照开放式载体的操作方法实现生物样本的无菌保存，彻底避免开放式载体玻璃化冷冻的污染或交叉污染风险，并且不影响降温速率、不会降低胚胎存活率。

为了解决上述问题，本发明提供了一种超低温冷冻及封闭式保存方法，其包括如下步骤：

1)提供一具有开口的无菌容器；

2)将所述无菌容器置于初始冷源中，且所述无菌容器开口的高度高于所述初始冷源的液面层；

3)在所述无菌容器中形成液化气体，作为无菌制冷剂；

4)将承载在载体上的待冷冻样品置于所述无菌制冷剂中进行玻璃化冷冻；

5)密封所述无菌容器，并将所述密封无菌容器与密封在其中的玻璃化冷冻样品一起超低温保存。

在一个优选的实施方案中，所述无菌容器的开口高于所述初始冷源所形成的蒸汽层。

在一个更优选的实施方案中，所述初始冷源是液氮、液氦或者其他超低温冷源。