[发明专利]基于活细胞3D打印的组织工程仿生肝叶结构及制备方法

说明书

本发明公开了一种基于活细胞3D打印的组织工程仿生肝叶结构及制备方法，其首先采集人体肝叶的生物信息，并输入计算机进行高仿生建模；然后通过生物3D打印机，利用水凝胶材料和用于构建人肝叶所需的肝、胆管上皮、血管内皮、平滑肌和成纤维等细胞进行材料单独打印与材料‑细胞混合打印输出，其中血管和胆管中的空洞部分用铸型剂打印；在所有水凝胶材料固化后，通过酶或螯合反应或温控或光照等手段去除血管和胆管中的铸型剂，构造出人工含胆管肝叶中的血管系统和胆管系统，通过血管系统两端的主血管与培养液输送管连接，实现仿生肝叶的血管系统循环供养与气体交换。其实现了仿生肝叶在体内外的长期存活和生物功能。

技术领域

本发明属于生物医学工程，特别涉及一种基于活细胞3D打印的组织工程仿生肝叶结构及制备方法，即采用生物3D打印的方式，制备出能长期存活和具有生物功能的人工血管化含胆管肝叶。

背景技术

现有的人工组织通常采用细胞的体外三维培养来制备，只能制备出小体积人工组织。当人工组织的厚度超过2毫米时就会造成组织深部供养障碍，导致人工组织难以长期存活。为解决深部供养障碍的问题，国内外研究者进行了多种不同的探索。例如将细胞接种在多孔支架上并浸泡在培养基中进行培养，使得营养物质能够通过孔道到达细胞处，但是该方法存在一定的局限性：随着细胞的生长，支架中的孔道会被细胞填满而阻塞营养物质的流通，并且该方法所形成的大体积人工组织由于有支架材料的阻隔难以形成如正常组织中的细胞功能集成；另外也有研究者采用能诱导血管长入的水凝胶材料来包裹细胞培养形成大体积人工组织并植入体内，让逐步长入的血管来供养，但是该方法任然存在深部供养障碍的问题，在血管还没有长入深部的时候，深部的细胞就已经因为缺少养分而死亡，难以实现真正的大体积人工组织的长期存活。

随着能够打印活细胞的生物3D打印技术的发展，人们开始利用生物3D打印技术来制备各种人工组织，其中就包括人工血管与人工肝组织。生物3D打印人工血管的出现，使得大体积人工组织的深部供养成为可能。现有最先进的生物3D打印人工肝组织主要是：1、杭州捷诺飞公司应用生物3D打印技术，以肝组织解剖学和生理学数据为基础，模拟肝小叶构建三维模型，用人肝干细胞打印具有功能结构的肝单元产品Regenovo3D Liver。打印的肝单元体积为人体肝小叶（高2mm，宽1mm）的10倍，并且可以在实验室条件下存活超过3个月，具有一定的肝叶功能；2、美国 Organovo 公司生产的微型肝叶产品exVive3D，其只有 0.5mm 厚、4 mm 见方。为制造这种结构，打印机叠加了约 20 层肝组织细胞和肝星状细胞，这是两种主要的肝细胞，另外还同时打印了血管内皮细胞，这些细胞形成管道网向肝细胞供应养分和氧气，使组织得以存活五天以上并具有一定的肝叶功能。

其中第一个产品存在使用细胞单一导致的功能不全问题和无血管系统导致的供养距离不足问题。由于血管网构建不完善，导致供养距离太短，所以打印的肝组织都较小（最厚处不超过5mm）。第二个产品存在存活时间较短、力学强度差和血管结构简单（构成细胞单一、网状结构简单）的问题。这两个产品受到血管系统系统和体外供养系统不全的限制，都存在打印的人工肝组织尺寸受限的问题，尺寸受限后就没有办法仿生大体积肝组织所具有的一些功能，比如缺少胆管这一结构，缺少胆汁运输功能。有些公司的产品通过打印时掺入内皮细胞，可能会形成一些管道，但是并不会形成具有血管完全功能（渗透、运输、联通循环）的血管网，这些形成的管道与真正的血管网的功能大相径庭。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种基于活细胞3D打印的组织工程仿生肝叶结构及制备方法，采用生物3D打印技术来制备人工含胆管肝叶，使之模拟人体肝叶的结构与生物功能，以实现人工含胆管肝叶在体内外的长期存活和生物功能。

本发明的目的是这样实现的：

一种基于活细胞3D打印的组织工程仿生肝叶的制备方法，包括如下步骤：

1）建模：