[发明专利]基于纳米孔的体外HIV蛋白酶检测仪器及方法

权利要求书

1.一种基于纳米孔的体外HIV蛋白酶检测仪器的制备方法，所述检测仪器包括血样分离芯片(1)、集成了纳米孔及存储了检测试剂的微流控芯片(2)、纳米孔检测电路系统(3)和系统采集控制系统(4)；血样分离芯片(1)的血样注入口(101)接收移液枪或者自动进样机加入的血样样本，流入混合通道(103)与裂解通道流入的裂解液混合，实现细胞裂解，混合溶液经过过滤膜(104)后，大分子样品被过滤并通过废液池接口流入废液池；没有被过滤掉的HIV蛋白酶(205)小分子穿过过滤膜流入到分离后样品流出接口(105)，并经接口(211)流入到纳米孔上层溶液通道(213)，与预先加入的靶蛋白(202)混合反应，将靶蛋白剪切为两个短片段(206、207)，该短片段在纳米孔检测电路系统(3)的电场作用下穿过纳米孔，产生过孔信号，最终通过系统采集控制系统(4)计算得出HIV蛋白酶的含量，并最终显示到电脑终端或者手机终端；

其中，固态纳米孔(201)为氮化硅纳米孔；纳米孔芯片安装在集成了纳米孔及存储了检测试剂的微流控芯片(2)中，并由微流道系统将纳米孔两侧分为两个腔室；

其中，在加样之前在上层溶液中加入未被剪切的靶蛋白，该上层溶液与纳米孔的接触面积受到玻璃微管的控制，小于5平方微米，实现噪声的最小化；这时纳米孔检测电路系统所检测到的电流信号为纳米孔的背景电流信号和未被剪切的靶蛋白所产生的过孔电流信号；待血样分离芯片的含有HIV蛋白酶的样品流入到上层溶液时，与靶蛋白反应产生剪切后的短蛋白A和剪切后的短蛋白B；对应纳米孔检测电路系统检测出短蛋白A所产生的电流过孔信号和短蛋白B所产生的电流过孔信号；通过系统采集控制系统分析不同蛋白信号的频率，幅度和过孔时间，计算出样品中HIV蛋白酶的具体含量；

其中，血样分离芯片留有用户加入待测血样样品的血样注入口(101)和裂解液注入口(102)，用户通过该入口加样；加入的样品在入口后方的S型管道中混合反应，实现样品的细胞裂解；微流控芯片的流道接口(211)与前处理芯片流出接口(105)连接，接收HIV蛋白酶样品溶液；

且微流控芯片的最中间部分安装有4个纳米孔的纳米孔芯片，纳米孔的孔径尺寸为1.2nm，微流控芯片将缓冲溶液分为上下层溶液，上层溶液固定在玻璃微管内与纳米孔芯片微接触，接触面积小于5平方微米，每个玻璃微管内部嵌入一个电极，分别与下层溶液的公共电极构成4个纳米孔检测电路电极对，电极连接到芯片外沿的金手指电路，进而在微流控芯片插入纳米孔检测电路系统时与系统电气连接；

基于玻璃微管的精确定位纳米孔制备为：

基于玻璃微管的固态纳米孔加工方法所需要设备：具有10nm操作精度的纳米操控台，具有测试输出一体的电打孔设备keithley2450以及玻璃微管拉制设备；

(1)在玻璃微管内注入1M/L的LiCl缓冲溶液，并安装在具有10nm操作精度的纳米操作台上，并将打孔设备正电极置入玻璃微管中；

(2)将20nm的氮化硅薄膜芯片安装在流通池内，并在氮化硅开窗面注入1M/L的LiCl缓冲溶液，去除多余气泡，保证溶液与氮化硅薄膜的良好接触；

(3)将该流通池安装在玻璃微管正下方，将打孔设备负电极置入流通池LiCl中；

(4)通过显微镜观察，调节操作台，将玻璃微管调至氮化硅薄膜正上方3微米处；

(5)设置打孔参数，包括恒定电流为5nA、氮化硅薄膜膜厚为20nm、电导率6.54S/m、限制电压为25V；

(6)点击打孔设备，开始打孔，同时控制操作台，缓慢逼近氮化硅薄膜，当玻璃微管与氮化硅薄膜接触且打孔设备电压小于5V时，停止打孔；

(7)测试IV曲线，得到孔径为1.2nm的氮化硅纳米孔。

2.根据权利要求1所述的基于纳米孔的体外HIV蛋白酶检测仪器的制备方法，其特征在于，裂解后的溶液经过过滤膜(104)，滤掉大分子成分并直接通过废液池接口流入废液池，而未被滤掉的包含有HIV蛋白酶的小分子溶液通过接口(105)流入到纳米孔芯片。

3.根据权利要求1所述的基于纳米孔的体外HIV蛋白酶检测仪器的制备方法，其特征在于，每个玻璃微管内部嵌入一个电极，分别与下层溶液的公共电极构成4个纳米孔检测电路电极对，电极连接到芯片外沿的金手指电路，进而在芯片插入检测电路时与系统电气连接。