[发明专利]一种针对COPD患者的原代支气管上皮细胞的分离培养方法

说明书

本发明提供了一种针对COPD患者的原代支气管上皮细胞的分离培养方法，所述细胞分类命名COPD患者原代支气管上皮细胞DHBE‑001，保藏编号为CCTCC NO：18169。该方法为，获取组织去除多余的结缔组织，解剖呼吸道，切成片段、清洗，将组织在离心管中消化并摇晃过夜；结束消化后将组织倒入组织培养皿中，加入胎牛血清至终浓度为10%，终止消化；用PBS缓冲液冲洗后收集到离心管中离心；加入组织消化液Ⅱ后静置直到看到组织块分离；加入FBS将溶液离心，弃上清，加入DMEM/F12培养基重悬后进行细胞计数；将离心沉淀的细胞置于含有BEGM培养基的培养皿中培养完成分离；本方法的细胞分离率高，纯度高，活力好，分离成功的原代支气管上皮细胞在体外培养5‑10代以内均能保持良好的细胞形态及活力。

技术领域

本发明属于细胞生物学技术领域，具体涉及一种人原代支气管上皮细胞的分离培养方法。

背景技术

在临床科研工作中，针对特定细胞功能和生物学特性的检查分析常常涉及到细胞的分离技术，从人的气管支气管中分离出单个支气管上皮细胞是体外进行免疫学和细胞学实验研究的重要前处理步骤，分离的目的细胞的质和量是保证后续实验可靠性的重要环节。

支气管上皮细胞（Human bronchial epithelial cells, HBEC）是由连续的上皮细胞层组成的，不仅是保护组织免受外界侵害，抵抗外界病原体感染的第一道生理防护屏障，也在气道炎症反应中扮演重要角色。过去人们认为上皮细胞只是一层简单的物理屏障，以阻止外界刺激性物质进入气道组织，但现在的观点认为，其作为免疫系统重要组分，具有介导固有免疫和获得性免疫相关细胞通讯及调控细胞活化的作用。

目前，普遍采用的是支气管上皮细胞株（BEAS-2B）作为研究对象，但实验结论表明此种细胞株没有原代支气管上皮细胞具有说服力，而且针对不同的研究对象（如慢阻肺、哮喘患者），原代的支气管上皮细胞更贴近人气道的生理环境，更能满足实验需求。

发明内容

为了解决现有技术的不足，本发明提供了一种针对COPD患者的原代支气管上皮细胞的分离培养方法。

本发明的目的通过以下技术方案来实现：

一种针对COPD患者的原代支气管上皮细胞，分类命名COPD患者原代支气管上皮细胞 DHBE-001，保藏编号为CCTCC NO：18169。保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：中国北京；保藏日期，2019-06-27。

优选地，所述的一种COPD患者原代支气管上皮细胞的分离培养方法，包括如下步骤：

S1、获取组织置于装有PBS缓冲液的培养皿中；所述组织为肺叶切除术后的肺组织；

S2、去除多余的结缔组织，解剖呼吸道，切成片段；

S3、准备组织洗涤液清洗三次；

S4、将组织转移到的离心管中通过组织消化液I消化并置于4℃摇床上摇晃过夜；

S5、结束消化，将离心管中的组织倒入组织培养皿中，加入胎牛血清至终浓度为10%，终止消化；

S6、用PBS缓冲液冲洗后收集到离心管中，采用500×g离心力，4℃下离心5min；

S7、加入组织消化液Ⅱ后置于37℃敷箱中，静置，直到视觉上看到组织块分离；

S8、加入FBS至终浓度为10%，将溶液转移至离心管中后，将离心管置于离心力500×g，4℃的离心机中离心5min；弃上清，加入DMEM/F12培养基重悬后进行细胞计数；

S9、将离心沉淀的细胞置于含有BEGM培养基的培养皿中含有 37℃、5% CO₂敷箱中培养，24h后换液，后每隔2-3天处理换液以完成分离。