[发明专利]提高水稻非生物胁迫抗性的OsEBP89基因及制备方法与应用

权利要求书

1.一种敲除OsEBP89基因在提高水稻非生物胁迫抗性中的应用，其特征在于，所述应用是提高水稻抗非生物胁迫能力，所述水稻抗非生物胁迫能力为抗旱，其中，所述OsEBP89基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的敲除OsEBP89基因在提高水稻非生物胁迫抗性中的应用，其特征在于，所述敲除OsEBP89基因是对所述OsEBP89基因编码区进行基因编辑，产生插入或缺失，该突变使基因翻译提前终止，形成OsEBP89基因的突变体knEBP89基因，所述knEBP89基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3/4/5所示，所述OsEBP89基因翻译提前终止使OsEBP89基因丧失功能。

3.根据权利要求2所述的敲除OsEBP89基因在提高水稻非生物胁迫抗性中的应用，其特征在于，所述敲除OsEBP89基因的sgRNA序列为：5’-gagtaacgaccggccctgctgg-3’，所述OsEBP89基因的引导RNA引物的核苷酸序列为：

OsEBP89-gRT+:5’-GAGTAACGACCGGCCCTGCgttttagagctagaaat-3’

OsEBP89-OsU6aT-:5’-GGGCCGGTCGTT ACTCCggcagccaagccagca；所述敲除OsEBP89基因的方法包括：利用PCR扩增的方法构建引导RNA靶点序列的sgRNA表达盒；将所述sgRNA表达盒装载到CRISPR/Cas9载体上，得到含靶点序列的CRISPR/Cas9-sgRNA载体；将靶点序列的CRISPR/Cas9-sgRNA载体转化水稻愈伤组织，得到水稻抗旱基因OsEBP89突变体。

4.根据权利要求3所述的敲除OsEBP89基因在提高水稻非生物胁迫抗性中的应用，其特征在于，所述的靶点序列CRISPR/Cas9-sgRNA载体的制备方法包含以下特征步骤：

a、以pYLsgRNA-OsU6a/LacZ质粒为模板，在两个反应体系中分别进行第一轮PCR扩增：gR-R和OsEBP89-U6aT-扩增OsU6a-靶点片段，U-F和OsEBP89-gRT+扩增gRNA-靶点片段；

b、PCR用U-GAL和Pgs-GAR引物扩增产生含靶点序列sgRNA表达盒，采取Gibsonassembly方法组装sgRNA表达盒和CRISPR/Cas9载体。