[发明专利]一种液相色谱串联质谱法定量血浆中百草枯试剂盒及其制备

说明书

本发明提供了一种高灵敏液相色谱串联质谱法定量血浆中百草枯试剂盒及其制备方法。试剂盒由特定浓度的标准曲线血浆样本、质控血浆样本、内标液、流动相调节液组成。血浆样本以百草枯‑d8为内标，用乙腈沉淀，采用Thermo acclaim trinity Q1为固定相，以乙腈‑100mmol/L甲酸铵和0.4％甲酸的水溶液为流动相进行色谱梯度分离，运用质谱仪进行定量检测，离子选择通道分别为m/z93.1→171.2(百草枯)和m/z97.1→179.2(百草枯‑d₈)。本发明的试剂盒，测试灵敏度可达到1.0ng/ml，各项方法学指标均可满足血浆中百草枯血药浓度定量检测的需要。

技术领域

本发明涉及一种基于液相色谱串联质谱技术开发的血浆中百草枯定量检测试剂盒，更具体地说是采用液相色谱质谱技术对血浆中百草枯进行准确定量检测的方法。

本发明还涉及本发明试剂盒的生产方法和应用。

背景技术

百草枯(PQ)是一种高极性的化合物，世界上使用最广泛的速效触杀型除草剂之一，在许多国家用于农业杂草的防治。百草枯既是一种除草剂，又是一种剧毒毒物。百草枯大鼠经口给药LD₅₀为150mg/kg，尽管在毒理学分类上被列为中等毒性毒物，但由于目前没有有效的解救药物，口服死亡率为90％，临床上应列为剧毒毒物。在过去的几十年里，出现了越来越多的关于百草枯意外中毒的报道，百草枯中毒死亡率非常高。百草枯的毒性作用可发生在多个器官，肺是百草枯中毒损伤的主要靶器官之一，它同时会造成严重的肝肾损害。百草枯中毒晚期则出现肺泡内和肺间质纤维化，称为“百草枯肺”，是急性呼吸窘迫综合征的一种变异形式。虽然百草枯毒性致死的主要原因是严重的肺损伤，但急性肾衰竭是百草枯毒性中观察到的第一个全身症状。急性百草枯中毒(acute paraquat poisoning)是指短时间接触较大剂量或高浓度百草枯后出现的以急性肺损伤为主，伴有严重肝肾损伤的全身中毒性疾病，口服中毒患者多伴有消化道损伤，重症患者多死于呼吸衰竭或多脏器功能衰竭。近百草枯中毒最常见的治疗方法是用膨润土使胃中的百草枯失活，或通过血液灌流法清除血液中百草枯。目前，每年约有上万人因百草枯中毒而丧失生命，急性百草枯中毒目前尚无解毒药物，救治仍处于探索中。清除进入体内的百草枯，改善百草枯的毒物分布情况，可能是目前救治急性百草枯中毒患者的基础和可行途径之一。

临床通过以下四种方式推断患者百草枯中毒后的预后情况：①通过研究计算得出的服毒量界值推断中毒200h内或4～24h间患者预后；②百草枯中毒严重指数(SIPP＝中毒到急诊时间×血浆百草枯浓度，h·mg/L)＞10或计算得出的cutoff推断中毒200h内或4～24h间患者预后；③Jones生存回归方程：生存概率＝exp(logit)/[1+exp(logit)]，logit＝0.58-2.33×log10血浆百草枯浓度-1.15×log10中毒到急诊时间；④Proudfoot生存曲线推断中毒4～24h间患者预后：血浆百草枯浓度在4、6、10、16和24h分别小于2.0、0.6、0.3、0.16和0.1mg/L的患者可能存活。临床中百草枯中毒患者预后评价需要准确定量体内百草枯浓度。

百草枯受自身理化性质因素影响，在反相色谱柱上很难保留，浓度测定存在较大难度，百草枯的分析检测方法有紫外分光光度法、色谱法、毛细管电泳法等多种方法，其提取方法也有液液萃取法、固相萃取法等多种，但操作繁琐，费时费力，不利于临床实践应用。目前国内外报道的检测方法主要有气相色谱串联质谱法(GC-MS)、液相色谱法(HPLC)和液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)。LC-MS/MS法是液相色谱作为分离系统与质谱作为检测系统的分析方法。它集LC的高分离性能与MS的高灵敏性、强专属性于一体，较好地适应了体内药物分析对高通量、高精密度和准确度的需求，近年得到越来越广泛地应用。

研究开发一种结果准确、价格低廉、操作简便、易于推广的LC-MS/MS定量血浆中百草枯试剂盒，使其能广泛应用于我国百草枯中毒患者体内毒物浓度监测中，通过准确定量血浆中百草枯浓度实现百草枯患者的精准预后评价。

发明内容