[发明专利]特异性结合PD-L1蛋白的核酸适配体及其用途

说明书

本发明提供由SEQ ID NO：1‑2所示的特异性结合PD‑L1蛋白的核酸适配体及其用途。具体地，本发明的核酸适配体及其衍生物相对PD‑L1蛋白抗体而言，具有能够化学合成、分子量小、稳定、易于保存和标记等优点。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种由SEQ ID NO：1-2所示的可用于特异性结合细胞程序性死亡-配体1(Programmed cell death 1ligand 1，PD-L1)蛋白的核酸适配体及其用途。

背景技术

程序性死亡受体1(programmed death-1，PD-1)是重要的免疫检查点，通过与其配体(programmed death ligand，PD-L)PD-L1和PD-L2的作用而抑制T细胞的活化及细胞因子的产生，在维持机体的外周耐受上发挥着至关重要的作用。PD-1诱导性表达于活化的T细胞表面，而PD-L1组成性的低表达于抗原递呈细胞(APCs)、多种间质细胞、血管内皮细胞、心脏、肝脏、胎盘组织等，是PD-1的主要配体。除此之外，在肿瘤微环境中，炎症因子的刺激会上调肿瘤细胞PD-L1的表达。正常情形下免疫系统会对聚集在淋巴结或脾脏的外来抗原产生反应，抗原特异性的细胞毒杀性T细胞(CD8+T细胞)会增殖，而PD-1与PD-L1结合，可以传导抑制性的信号，对CD8+T细胞的进一步增殖和活化有显著的抑制作用。肿瘤细胞能借助此途径逃逸细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的杀伤作用，从而减弱机体对肿瘤细胞的免疫应答。

核酸适配体(aptamer)是指通过指数富集的配基系统进化技术(SELEX)筛选分离得到的DNA或者RNA分子，它可以与其他靶标如蛋白质、金属离子、小分子、多肽甚至整个细胞进行高亲和力和特异性的结合，因此在生化分析，环境监测，基础医学，新药合成等方面展示广阔的前景。核酸适配体与抗体相比具有分子量小、稳定性更好、易改造修饰、无免疫原性、制作周期短、可以通过人工合成等优势，免去了动物免疫、饲养、蛋白提取和纯化等一系列流程，因此核酸适配体是一种非常理想的分子探针。

以PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂为代表的免疫治疗现已成为肿瘤治疗领域最具前景的治疗手段。截至目前为止，FDA已经批准了5种PD-1/PD-L1抗体药物用于晚期黑色素瘤、晚期非小细胞肺癌、头颈鳞状细胞癌、经典型霍奇金淋巴瘤、转移性尿路上皮癌、膀胱癌、转移性胃癌、晚期肾癌等多种癌症的一线或二线治疗方案。PD-1抗体药物通过与T淋巴细胞上PD-1结合，PD-L1抗体药物通过与肿瘤细胞上PD-L1结合来阻断PD-1和PD-L1信号通路传导，解除肿瘤细胞对T淋巴细胞的免疫抑制作用，从而促进T淋巴细胞的活化，释放IL-2、INF-γ等细胞因子或者直接分泌颗粒酶和穿孔素杀伤肿瘤细胞。因此，PD-1/PD-L1抑制剂发挥作用的前提是能够识别相应PD-1/PD-L1靶标，阻止PD-1和PD-L1相互之间的结合。基于SELEX的筛选原理，PD-1/PD-L1核酸适配体用于肿瘤免疫治疗的可行性也被广泛研究。目前已经有一些研究者公布了他们所发现的一些PD-L1的核酸适配体序列，并在荷瘤小鼠模型上验证了其抗肿瘤增殖的能力，发现PD-1/PD-L1核酸适配体和PD-1/PD-L1抗体具有相似的抗肿瘤免疫功效。然而，这些PD-1/PD-L1的核酸适配体存在一些缺点，例如，有些核酸适配体的靶标是鼠源PD-1/PD-L1蛋白，实际应用受限；有些核酸适配体分子量大，针对PD-L1蛋白的结合亲和力不太高、特异性不好、稳定性不高等。因此，本领域对具有针对人源PD-1/PD-L1蛋白的结合亲和力更高的核酸适配体存在需求。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种具有高度特异性、分子量小、化学性质稳定、易于保存和标记的能够结合PD-L1蛋白的核酸适配体及其衍生物，还相应提供所述核酸适配体的用途。

具体地，本发明人设计并合成了一个随机单链DNA文库和相应的引物，用来筛选具有高度特异性、分子量小、化学性质稳定、易于保存和标记的能够结合PD-L1蛋白的核酸适配体，由此筛选得到一些特异性结合PD-L1蛋白的核酸适配体，并检测了它们与PD-L1蛋白的结合能力。在此基础上，本发明人完成了本发明。