[发明专利]经诱变的高产天然维生素K2的枯草芽孢杆菌菌株及其应用

说明书

本发明公开经诱变的枯草芽孢杆菌菌株及其应用。当在液体培养基中，37℃温度下以180r/min培养3天后，本发明的菌株发酵液中维生素K2的含量为62.08mg/L以上，且该发酵产生维生素K2的能力至少能够维持10代传代培养。与目前已知的枯草芽孢杆菌相比，本发明的菌株产维生素K2的能力提高至少24倍。

技术领域

本发明涉及微生物的改造，具体涉及稳定高产维生素k2的枯草芽孢杆菌菌株及其应用。

背景技术

纳豆芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌的一个亚种，可分泌合成多种有机酸、酶、生理活性物质等，促进小肠黏膜细胞增殖，使肠道酸化利于铁、钙及维生素D等的吸收。枯草芽孢杆菌作为重要的工业生产益生菌，能够合成a-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类，从而在食品、酶制剂、饲料行业得到广泛的应用。该菌为美国FDA公布的40种益生菌之一，食用安全，基因组清晰，早在1995年Rowland等就系统阐明了枯草芽抱杆菌基因组。然而，天然菌株因生长繁殖能力弱，产酶效率低等缺点而不能用于工业生产。

维生素K2(Menaguinone，MK)是一种脂溶性维生素，具有叶绿醌生物活性的萘醌基团的系列衍生物，共有14种同系物，是人体中不可缺少的重要维生素之一。有多种结构形式，其中最常见的是合成的MK-4和天然的MK-7。WHO的数据表明，MK-7是公认的优质天然维生素K2，几乎完全被人体吸收，并留在血液中的时间最长。且活性高，仅能通过微生物发酵法获得。因其在食品中含量极少，素有“铀金维生素”之称，具有预防和治疗骨质疏松、动脉钙化、心血管疾病、肿瘤及帕金森症等多种重要的生理功能。其安全性已得到美国FDA、中国食品药品监督管理局、美国药品研究所及欧洲议会和欧盟理事会的权威认定。传统的维生素K2一般采用化学合成法生产，但存在化学前体原料来源限制、化学反应产生大量异构体、副产物多、产率低、带来环境污染等问题，且合成的维生素K2，其异戊二烯侧链多是顺式结构，活性较低。而活性更高的天然维生素K2(MK-7)仅能通过微生物发酵法获得，因此，微生物发酵法越来越受到人们的欢迎，具有广阔的应用前景。其中纳豆枯草芽抱杆菌因其生长速度快、易于培养、维生素K2含量高等优势，成为发酵生产维生素K2最主要的微生物，是目前进行工业化生产的理想菌种之一。但是野生菌种维生素K2的产量3mg/L，难以满足生产的需求。

发明内容

为解决现有技术中的至少部分技术问题，本发明利用紫外(UV)物理诱变和亚硝基胍(NTG)化学诱变改造现有菌株，抗性筛选高产菌株，得到高产天然维生素K2的菌株。至少部分地基于此完成本发明。具体地，本发明包括以下内容。

本发明的第一方面，提供一种经诱变的枯草芽孢杆菌菌株(有时也称作“本发明的菌株”)，与目前已知的枯草芽孢杆菌相比，本发明的菌株具有更高的维生素K2发酵能力。当在液体培养基中，接种4％，2×10⁶cfu/ml的菌株于37℃温度下以180r/min培养本发明的菌株3天后，其发酵液中维生素K2的含量为62.08mg/L以上，优选65.79mg/L，一般情况下，野生枯草芽孢杆菌菌种的维生素K2的产量3mg/L，而本发明的产量为62.08mg/L以上，产量增加24倍以上，优选26倍以上。

本发明中，上述培养的液体培养基为葡萄糖0.5wt％、可溶性淀粉0.5wt％、大豆蛋白0.5wt％、蛋白胨1wt％、MgSO₄ 0.5wt％、K₂HPO₄ 0.1wt％和NaCl 0.5wt％。

在优选的实施方案中，本发明的经诱变的枯草芽孢杆菌菌株还具有优异的稳定性。当经诱变的枯草芽孢杆菌菌株经至少10代传代培养后，在液体培养基中37℃温度下以180r/min培养3天，其发酵液中维生素K2的含量仍维持62.08mg/L以上，优选65.79mg/L。即，本发明的菌株不会因传代而降低维生素K2的发酵能力。

在某些实施方案中，本发明的经诱变的枯草芽孢杆菌菌株为纳豆芽孢杆菌。