[发明专利]基于太赫兹波技术的无标记评估水通道蛋白功能的方法

说明书

本发明涉及一种基于太赫兹波技术的无标记评估水通道蛋白功能的方法，在构建的太赫兹超材料芯片表面接种细胞，培养至细胞贴壁生长并完全融合成单细胞层，然后采用太赫兹时域光谱仪测定等渗缓冲液中细胞层的谐振峰情况；更换低渗缓冲液，大量水分子通过水通道蛋白进入细胞内部，使得初始细胞体积增大，形成溶胀后的细胞，采用太赫兹时域光谱仪实时获取贴壁细胞层在渗透压变化时的谐振峰变化情况，有效反映细胞溶胀程度，即水分子通过细胞层的渗透状况，并根据实时响应曲线求得达到最大响应值所需时间的倒数，实现细胞水通道蛋白功能情况的无标记评估，可用于相关靶向AQP药物的高通量筛选。

技术领域

本发明属于太赫兹测量技术领域，涉及一种基于太赫兹波技术的无标记评估水通道蛋白功能的方法。

背景技术

水是生命之源。水通道蛋白(aquaporin,AQP)是位于细胞膜上的跨膜蛋白，选择性高效转运水分子的通道。自1991年首次报道第一个水通道蛋白(AQP1)以来，研究者相继发现广泛分布于不同器官的13种水通道蛋白，对于维持器官正常生理功能发挥至关重要的作用。AQP表达量和功能状态与肿瘤、脑血管疾病、肾脏疾病等多种疾病密切相关。特别是AQP在肿瘤组织中表达上调，通过快速转运水分子进入肿瘤细胞介导其迁移、增殖和侵袭，并参与肿瘤新生血管的形成。因此准确评估细胞AQP功能状态、用于研发靶向AQP的阻断剂、抑制剂乃至激动剂是当前肿瘤靶向治疗和成像的热点所在。

细胞AQP功能评估主要通过测量水分子在胞外渗透压变化情况下透过胞膜的转运情况，宏观表现为细胞的体积和水含量改变。基于此目前评估细胞AQP功能方法有光散射法、显微图像测量法、光干涉法、离子浓度敏感型荧光标记等方法。光散射法受限于伪影信号产生，已较少应用；显微图像测量仅应用于表达AQP的非洲蟾蜍卵母细胞在细胞溶胀过程体积改变的分析，数据变异性较大、可靠度较低；激光干涉对仪器的光束对准及振动要求较高，实用性不强。来自AQP功能研究领域领军人Verkman的研究揭示：传统基于体积测量的AQP功能评估方法可靠性较低，因而难以有效筛选真正抑制AQP功能的药物。荧光标记法则成为可靠的评估方法，其通过对生长在固体支持物上的细胞层进行胞质钙黄绿素染色或转染绿色荧光蛋白，可利用全内反射荧光平台测定渗透梯度改变时荧光信号的变化获得细胞容量动力学改变参数，具有伪影误差小、光漂白效应低及结果稳定性高的显著优势。但其仍是有标记检测，会损伤细胞活性；且由于倏逝波穿透深度限制，仅能获得亚微米尺度的细胞层部分信息。综上，目前尚缺乏一种无标记、可靠的细胞AQP功能评估方法。

太赫兹(Terahertz，THz)波技术是一种新型无标记检测技术。它是频率在0.1～10THz(对应波长范围为30μm-3mm)的电磁波，处于微波向红外过渡的波段，具备无标记检测的频谱优势：1THz振荡频率对应0.16皮秒转动，相较磁共振、准弹性中子散射和非相干中子散射等传统方法，THz技术无需氢氘置换或低温冷却，可将检测胞内水分子运动尺度从飞秒水平提升至皮秒及亚皮秒水平，从而实现精确、实时分析细胞内自由水和结合水的水化动力学，具备应用于细胞AQP功能实时评估的潜能。但是，THz波应用于活细胞检测仍面临THz波长(1THz～300μm)与细胞层厚度(约5～10μm)间存在的尺度失匹配问题，以及液相环境中对水强烈吸收干扰(1THz处水吸收系数约为230cm^-1)等问题。目前尚无将太赫兹波技术应用于细胞AQP功能无标记评估领域的相关报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于太赫兹波技术的无标记评估水通道蛋白功能的方法。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

基于太赫兹波技术的无标记评估水通道蛋白功能的方法，具体步骤如下：

(1)构建太赫兹超材料芯片；

(2)在步骤(1)所构建的超材料芯片表面接种细胞，培养至细胞贴壁生长并完全融合成单细胞层，然后采用太赫兹时域光谱仪测定等渗缓冲液中细胞层的谐振峰情况；