[发明专利]重组表达载体、靶向性的T细胞及它们的应用

说明书

本发明属于肿瘤生物制品领域，具体地，重组表达载体、靶向性的T细胞及它们的应用。重组表达载体含有能够表达RNAi的核苷酸序列和能够表达嵌合抗原受体的核苷酸序列；RNAi能够沉默PD‑1；嵌合抗原受体为ScFv‑CD8‑CD137‑CD3ζ。通过基因工程的方法将T细胞内的PD‑1基因表达抑制，从而阻断PD‑1信号通路，实验表明CART细胞中的PD‑1的敲低可能改变了细胞因子分泌模式，但是增强了对PD‑1介导的免疫抑制的抵抗。此外，本发明通过基因工程手段制备的PD‑1沉默的CART细胞既结合了T细胞治疗的优点，又解除了免疫检验点的调控，可很大程度上解除肿瘤微环境对CART细胞免疫功能的抑制。

技术领域

本发明属于肿瘤生物制品领域，具体地，涉及一种重组表达载体、含有该重组表达载体靶向性的T细胞及其应用。

背景技术

肿瘤是严重威胁人类健康的常见病和多发病，已成为威胁人类健康的第一“杀手”。肿瘤不仅严重威胁人类的健康，同时会给患病家庭和社会带来沉重的负担。因此，研发或改进新的肿瘤治疗手段具有重要的临床意义和社会意义。

肿瘤的发生和进展与诸多因素有关，累积的基因突变是肿瘤发生的内在因素。在正常状态下，突变的肿瘤细胞会被免疫系统及时识别并清除。当人体免疫力下降或存在缺陷时，免疫系统无法及时识别和杀伤肿瘤细胞，便会引起肿瘤的发生。免疫治疗作为一种新的肿瘤治疗手段，正是通过改善和指导人体免疫系统对肿瘤的杀伤来达到治愈肿瘤的目的。

免疫治疗的手段有很多，如细胞因子激活的杀伤性(cytokine induced killer,CIK)细胞、树突状细胞(dentritic cells,DC)疫苗、自然杀伤性(natural killer,NK)细胞及嵌合型抗原受体修饰的T(chimeric antigen receptor modified T cells,CART)细胞等。其中，CART疗法以其精准、特异、直接的特点，取得了令人鼓舞的临床效果。嵌合性抗原受体由识别肿瘤抗原的单链抗体(scfv)、激活T细胞CD3-zeta链以及共刺激信号CD28或CD137组成。该受体可直接介导T细胞对肿瘤的识别及杀伤，不依赖于传统TCR与MHC的结合，从而有效规避了肿瘤细胞低表达MHC分子造成的T细胞对肿瘤细胞的识别障碍。例如，以CD19为靶点的CART-19对于急性B细胞白血病可以取得90％以上的临床有效率。

CART疗法进展很快，但其对于某些病种的治疗效果仍然不理想。其中，肿瘤微环境中存在多种抑制免疫系统的机制，例如肿瘤会分泌TGF-β、白介素6(interleukin-6，IL-6)或表达免疫监测点蛋白配体PD-L1等抑制T细胞的激活并诱导产生抑制型免疫细胞，从而起到保护肿瘤不受免疫细胞杀伤的作用。

PD-1是由人PDCD1基因编码的由268个氨基酸组成的跨膜蛋白，PD-1在激活的T细胞、B细胞和巨噬细胞表面有表达，是免疫检验点蛋白之一。当T细胞激活后，其激活的TCR/ZAP70、PI3K/AKT等信号通路会上调PD-1分子的表达。PD-1有PD-L1和PD-L2两种配体，PD-L1在多种免疫细胞和人体组织中有低表达，在几乎所有的肿瘤组织中高表达；PD-L2主要在DC和少数肿瘤中有表达。与配体结合后，PD-1会通过抑制T细胞受体(T cell receptor,TCR)信号激活而影响T细胞的活化和扩增，并促进效应T细胞的凋亡。通常，PD-1信号通路在抑制T细胞过度激活、下调免疫系统活性、避免自身免疫疾病和促进免疫耐受中扮演着重要的角色。