[发明专利]一种表达D-苏氨酸醛缩酶的重组菌及其构建方法与应用

说明书

本发明公开了一种表达D‑苏氨酸醛缩酶的重组菌及其构建方法与应用，属于酶工程技术领域。本发明的重组菌表达了氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的D‑苏氨酸醛缩酶。本发明提供了一种D‑苏氨酸醛缩酶可作为催化剂应用于手性β‑羟基‑α‑氨基酸的合成，其催化效率高(转化率65％)、立体选择性强(e.e.99％，d.e.95％)、适用的反应条件温和、环境友好。本发明的D‑苏氨酸醛缩酶催化效果佳，底物适用性广，具有很好的应用开发前景。

技术领域

本发明涉及一种表达D-苏氨酸醛缩酶的重组菌及其构建方法与应用，属于酶工程技术领域。

背景技术

手性β-羟基-α-氨基酸是一类非常重要的化合物，因其具有手性羟基和氨基酸两个官能团，在医药、材料等精细化学品的制造中具有非常广泛的应用。化学法合成手性β-羟基-α-氨基酸具有催化剂昂贵、重金属污染、合成路线较长以及在较为苛刻的条件下才能提高产物的立体选择性等缺点，不利于工业生产的放大。与化学法相比，酶法不需要任何保护基，具有更好的立体选择性，反应可以一步完成等优点。因此，酶法合成β-羟基-α-氨基酸更具有应用开发的潜力。

苏氨酸醛缩酶是一类磷酸吡哆醛依赖型的醛缩酶，是有机合成中碳-碳键形成的强有力工具，它可以催化带有不同取代基的醛和甘氨酸发生特异的羟醛缩合反应生产出高附价值的β-羟基-α-氨基酸，在形成的两个手性中心的α-碳具有高度的选择性，而β-碳的立体选择性较差。因此，开发高效、高立体选择性的苏氨酸醛缩酶，对于合成甲砜霉素、氟苯尼考等药物的手性中间体(l-syn-对甲砜基苯丝氨酸)的技术转型升级具有重要意义。

目前，对于l-syn-对甲砜基苯丝氨酸的酶法生产，大多是通过酶法拆分dl-syn-对甲砜基苯丝氨酸获得。其中，在两相体系下(二氯甲烷、二氯乙烷、环已酮)，来源于Delftiasp.RIT313的D-苏氨酸醛缩酶能够完全拆分300mmol·L^-1 dl-syn-对甲砜基苯丝氨酸，是目前最高底物浓度(Catalysis ScienceTechnology,2017,7,5964-5973)。然而，酶法合成l-syn-对甲砜基苯丝氨酸的研究报道较少。来源于P.putida的l-苏氨酸醛缩酶催化对甲砜基苯甲醛和甘氨酸合成l-syn-对甲砜基苯丝氨酸产率为68％，d.e.值仅为53％(Tetrahedron,2007,63,918-926)。较低的酶活和立体选择性一直以来都是制约苏氨酸醛缩酶应用的瓶颈，急需开发新型的具备高活性和高立体选择性的苏氨酸醛缩酶来满足工业化应用的要求。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种表达D-苏氨酸醛缩酶的重组菌，生产的D-苏氨酸醛缩酶可高效催化对甲砜基苯甲醛和甘氨酸合成l-syn-对甲砜基苯丝氨酸，产率为65％以上，d.e.值为95％以上。该过程具有条件温和、操作简单等优点。

本发明的第一个目的是提供一种表达D-苏氨酸醛缩酶的重组菌，所述重组菌表达了氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的D-苏氨酸醛缩酶。

进一步地，所述的重组菌是以是细菌、真菌、植物、昆虫或动物细胞为宿主细胞。

进一步地，所述的重组菌是以大肠杆菌为宿主菌。优选大肠杆菌BL21(DE3)。

进一步地，所述的重组菌的表达载体为细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒或哺乳动物细胞病毒。

进一步地，所述的重组菌的表达载体为pET系列表达载体。优选pET28a。

本发明的第二个目的是提供所述重组菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)构建重组质粒pET28a-ApDTA：将D-苏氨酸醛缩酶基因ApDTA与酶切过的质粒pET28a进行连接，得到重组表达载体pET28a-ApDTA；