[发明专利]一种诱导辽东楤木体细胞胚发生及植株再生的方法

说明书

本发明公开了一种诱导辽东楤木体细胞胚发生及植株再生的方法,包括以下步骤：S1、外植体的选择与处理；S2、愈伤组织的诱导；S3、愈伤组织的增殖培养；S4、胚性愈伤组织的诱导；S5、胚性愈伤组织分瓶培养；S6、再生根培养；S7、驯化移栽，本发明培养速度快，经济适用性高，可用于优异野生种质资源的保存与繁殖，满足园艺栽培和中草药的规模化种植。

技术领域

本发明涉及种植技术领域，尤其涉及一种诱导辽东楤木体细胞胚发生及植株再生的方法。

背景技术

辽东楤木是五加科楤木属的一种多年生落叶小乔木或灌木，其嫩芽，是名贵的食用山野菜，质地脆嫩，气味独特，营养丰富，被誉为“山菜之王”，其根、茎皮、叶等组织含有丰富的楤木皂甙，具有很高的食用价值和药用价值。近年来，随着辽东楤木芽菜大量出口日本，导致东北林区野生辽东楤木资源严重破坏，人们开始研究辽东楤木人工栽培技术。辽东楤木扩繁可采用4种方法：一是利用种子进行有性繁殖培养实生苗；二是利用根段进行无性繁殖生产插条苗和埋根苗；三是利用辽东楤木萌蘖能力强的生物学特性进行分株繁殖；四是利用植物细胞的全能性进行组织培养生产组培苗。由于辽东楤木种子休眠期较长，实生繁殖存在出苗不整齐且时间长的问题，而无性繁殖生产插条苗和埋根苗繁殖系数和成活率较低。利用组织培养技术能够实现种苗的快速繁育，解决稀有野生资源的保存问题。

辽东楤木植株再生有两种途径，一是愈伤组织形成途径，二是胚状体形成途径。辽东楤木通过愈伤组织再生途径，诱导率低，需要多次继代培养，一般需要6-10个月，繁殖周期较长。目前胚状体形成途径有两种方式，一是直接从外植体形成体细胞胚(Dai J L,TanX,Zhan Y G,et al.Rapid and repetitive plant regeneration ofAraliaelataSeem.via somatic embryogenesis[J].Plant Cell Tissue and Organ Culture,2011,104(1):125-130.)，这种方法体细胞胚诱导率和繁殖系数较低，平均每个外植体能生成 10-15个体细胞胚。二是先形成愈伤组织，再诱导形成体细胞胚(CN 108064697 A)，这种方法繁殖系数高，但仍存在以下不足，不同外植体诱导愈伤的激素浓度不明确，愈伤组织增殖系数低；单独添加IBA, 愈伤组织更多的是分化成不定根，分化后形成愈伤组织、不定根、不定芽及完整体细胞胚的混合体，体细胞胚分离困难，利用率低；体细胞胚接种到生长培养基上后容易在基部形成愈伤组织团及次级体细胞胚，驯化移栽困难。针对现有技术的不足，本发明旨在提供一种更加有效的辽东楤木体细胞胚发生及植株再生的方法，有效提高体细胞胚诱导和增殖效率，从而建立更加高效的辽东楤木植株再生体系。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种诱导辽东楤木体细胞胚发生及植株再生的方法。

一种诱导辽东楤木体细胞胚发生及植株再生的方法，包括以下步骤：

S1、外植体的选择与处理：以5至7月份旺盛生长期植株的幼嫩叶片、茎和叶柄为外植体进行愈伤组织诱导，采回来的外植体先用流水冲洗干净，然后在超净工作台上用70％酒精浸泡消毒，叶片浸泡 30-60秒，叶柄和茎浸泡2-4分钟，用无菌水冲洗2-4次，再用氯化汞消毒7-10min，无菌水冲洗2-4次，用无菌滤纸吸干水分，用解剖刀将叶片切割成约1cm²的正方形，叶柄和茎切割成0.2-0.5cm的小段，接种到愈伤组织诱导培养基上；

S2、愈伤组织的诱导：以添加了2,4-D，蔗糖(30g/L)琼脂(6.5g/L) 的MS培养基为诱导培养基，叶片诱导愈伤的2,4-D浓度为 0.5mg/L-1.0mg/l，茎和叶柄诱导愈伤的2,4-D浓度为 1.0mg/L-3.0mg/L，愈伤组织的诱导条件：温度25±1℃，湿度 60％-70％，暗培养10-15天后转至12h/12h(2000lx)光培养，5天后开始生成淡黄色、疏软的愈伤组织，30-45天愈伤组织转至增殖培养基；