[发明专利]利用二乙酰胺四乙酸钠对骨骼或牙齿进行DNA提取的方法

说明书

本发明公开了一种利用二乙酰胺四乙酸钠对骨骼或牙齿进行DNA提取的方法，利用裂解液中的二乙酰胺四乙酸钠成分对骨骼或牙齿中的钙质成分的螯合作用，对骨骼或牙齿进行脱钙，然后利用裂解液中的表面活性剂及蛋白酶K成分对骨骼或牙齿中的细胞膜及蛋白质进行裂解消化，释放DNA成分，最后经过一系列的分离、漂洗、洗脱步骤，提取得到DNA；裂解液中的乙二酰胺四乙酸钠成分对骨骼或牙齿中的钙成分具有更强的螯合作用，能更加高效快速地对骨骼或牙齿进行脱钙，提高了DNA提取得率的同时还缩短了提取时间。

技术领域

本发明属于DNA提取技术领域，具体涉及一种利用二乙酰胺四乙酸钠对骨骼或牙齿进行DNA提取的方法。

背景技术

在骨骼、牙齿等生物样本中，含有大量的金属钙元素成分，由于大量钙化合物的存在，使得DNA提取过程中，溶液很难进入到骨头、牙齿内部，从而阻止了对骨头、牙齿内部细胞的裂解消化。同时也是由于钙化合物的存在，使得其内部的细胞或DNA更能耐受微生物的分解，因此，在法医DNA领域或古生物领域，骨骼或牙齿经常成为唯一有可能用于DNA提取的样本。

金属螯合剂(metal chelating agent)可以通过螯合剂分子与金属离子的强结合作用，将金属离子包合到螯合剂内部，变成稳定的，分子量更大的化合物，从而阻止金属离子起作用。金属螯合剂种类繁多，作用能力各有差异，现有技术中，金属螯合剂EDTA在骨骼、牙齿等生物样本的DNA提取中被广泛使用，本发明提供一种利用二乙酰胺四乙酸钠对骨骼或牙齿进行DNA提取的方法，该发明方法使用了螯合能力更强的金属螯合剂乙二酰胺四乙酸钠。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种利用二乙酰胺四乙酸钠对骨骼或牙齿进行DNA提取的方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

利用二乙酰胺四乙酸钠对骨骼或牙齿进行DNA提取的方法，包含以下操作步骤：

(1)将300mg骨骼粉末或牙齿粉末放入离心管中，往其中加入500ul裂解液，于50-60℃条件下加热裂解1-12小时；

(2)将步骤(1)中的离心管置于离心机中，以12000转每分钟的速度离心1-5分钟，将上清液转移至新的离心管中，加入750ul结合液并混合均匀；

(3)将步骤(2)新的离心管中的混合液转移至离心柱中，将离心柱置于离心机中，以12000转每分钟的速度离心0.5-2分钟；

(4)倒弃步骤(3)离心柱收集管中的液体，将离心柱放回离心柱收集管内，往离心柱中加入700ul漂洗液，于离心机中12000转每分离心0.5-2分钟；

(5)倒弃步骤(4)离心柱收集管中的液体，将离心柱放回离心柱收集管内，于离心机中12000转每分离心2-5分钟；

(6)将步骤(5)离心柱放入新的离心管内，往离心柱底部的硅胶膜中加入10-200ul洗脱液，静置3-10分钟，于离心机中以12000转每分钟的速度离心0.5-2分钟，丢弃离心柱，离心管内液体即为DNA溶液。

进一步，步骤(1)所述裂解液包含:10-500mmol/l二乙酰胺四乙酸钠、0.1-2％(w/v)十二烷基硫酸钠、0.1-5mg/l蛋白酶K、0-0.1mol/l二硫苏糖醇、5-100mmol/l三羟甲基氨基甲烷,pH值7.0-8.5。

进一步，步骤(2)所述结合液包含：40％-60％(w/v)异硫氰酸胍、8-18％(w/v)曲拉通X-100、50-200mmol/l柠檬酸钠，pH值5.0-6.0。

进一步，步骤(3)所述离心柱为分子生物学实验中常用耗材，其底部装配有硅胶膜。

进一步，步骤(4)所述漂洗液为70-85％(v/v)乙醇。