[发明专利]一种植物转基因细胞制备方法

权利要求书

1.一种植物转基因细胞制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：从植物供体中采用酶切法获取目的基因；

S2：用PCR技术扩增目的基因，目的基因的扩增步骤为：

A：将目的基因倒入加热容器中，调节温度，加热至90～95℃，持续1-2分钟，DNA解链；

B：降低温度，将温度调节到45-55℃，并加入引物、四种脱氧核苷酸和DNA聚合酶，结合到互补DNA链；

C：升高温度，将温度调节到70-75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成；

S3：选取载体和目的基因构建基因载体；

S4：通过基因枪将基因载体导入受体细胞。

2.根据权利要求1所述的一种植物转基因细胞制备方法，其特征在于，所述S1中，目的基因的获取步骤为：

(1)、从植物供体中制备纯度为90％以上的染色体基因组DNA；

(2)、向基因组DNA溶液中加入一定量的限制酶，限制酶将DNA切割成若干个片段；

(3)、将DNA片段分别与适当的载体分子进行体外连接；

(4)、将重组的载体包装成噬菌体,放入培养基中培养，保持适宜的温度，并加入培养液；

(5)、观察培养基中的噬菌斑,筛选阳性克隆,再将其克隆中的目的基因提取分离出来，得到目的基因。

3.根据权利要求2所述的一种植物转基因细胞制备方法，其特征在于，所述培养液为水、无机盐、维生素、蔗糖、氨基酸和激素的混合物，植物细胞的分裂和生长需要植物激素的调节，促进生长的生长素和促进细胞分裂的分裂素是最基本的激素，激素是由吲哚乙酸和细胞分裂素混合而成，且吲哚乙酸和细胞分裂素的质量比例的1:2。

4.根据权利要求1所述的一种植物转基因细胞制备方法，其特征在于，所述S2中，PCR技术扩增目的基因过程中，在引入酶切位点后，加入凝血酶，促进细胞的分裂，扩增目的基因。

5.根据权利要求1所述的一种植物转基因细胞制备方法，其特征在于，所述S3中，选取质粒载体，在质粒载体上剪出带有粘性末端的切口，将带有相同粘结末端的目的基因片段导入切口内，添加DNA连接酶和抑制剂，生成基因表达载体。

6.根据权利要求5所述的一种植物转基因细胞制备方法，其特征在于，所述抑制剂为碱性磷酸酶，在目的基因上的粘性末端与质粒载体上的粘性切口粘接时，会产生一定数量的载体环化分子，碱性磷酸酶抑制环化分子的产生，使得基因上的粘性末端可以和质粒载体上的粘性切口相粘结，使得基因表达载体生成，提高基因表达载体生成的数量。

7.根据权利要求1所述的一种植物转基因细胞制备方法，其特征在于，所述S4中，基因载体导入受体的过程为将直径4um的钨粉或金粉在供体DNA中浸泡2-3分钟，然后启动基因枪，将这些粒子打入细胞、组织或器官中，小颗粒穿钨粉或金粉透力强，不需除去细胞壁和细胞膜而进入基因组，实现稳定转化，基因枪转化时间短，转化频率高。