[发明专利]一种家蚕表达重组蓖麻毒素蛋白A链的方法

说明书

本发明公开了一种家蚕表达重组蓖麻毒素蛋白A链的方法。以蓖麻籽抽提获得的总RNA为模板PCR处理获得蓖麻毒素蛋白A链基因的PCR产物；利用家蚕核型多角体病毒BmNPV作为载体，构建了含有蓖麻毒素蛋白A链基因的重组病毒，利用家蚕作为重组杆状病毒的宿主表达具有生物活性的重组蓖麻毒素蛋白A链。本发明以家蚕作为宿主生产重组蓖麻毒素蛋白A链，具有较强的生物活性，有利于蛋白质的快速提取，为该蛋白A链在医学和治疗领域上的应用提供了新的途径。

技术领域

本发明涉及DNA重组技术、蛋白质的表达方法，尤其是涉及利用家蚕杆状病毒表达系统表达生产重组蓖麻毒素蛋白A链的方法。

背景技术

蓖麻毒素是从蓖麻籽中提取的植物糖蛋白，分子量64,000。毒素由A和B两条多肽链组成，两链间由一个二硫键连接。目前，A链和B链的氨基酸序列以及二级结构已清楚。毒素A链由263个氨基酸组成，分子量大小32KDa，毒素B链上含有两个半乳糖或半乳糖残基结合位点，可和细胞表面的含半乳糖残基的受体结合，通过内陷作用进入细胞质，发挥毒性作用。蓖麻毒素A、B链上还分别含有1和2个糖支链，链末端均为甘露糖残基，可以和网状内皮细胞特别是巨噬细胞结合。后者细胞表面富含甘露糖受体，可优先摄取蓖麻毒素，这对于毒素发挥生物功能有重要的作用。

蓖麻该毒素易损伤肝、肾等实质器官，发生出血、变性、坏死病变。并能凝集和溶解红细胞，抑制麻痹心血管和呼吸中枢，是致死的主要原因之一。但目前最新的研究发现，该毒素具有诱导细胞凋亡的作用，因此，通过靶向作用，该毒素在肿瘤治疗领域有很好的应用前景。

鉴于该毒素在蓖麻中的含量极低，加上提纯难度大，因此，十分有必要进行体外表达，开发一种高效且经济的方法进行生产。由于该毒素毒性大，一般的表达系统，如大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞等表达水平较低，另外由于该蛋白需要糖基化，大肠杆菌等原核表达系统修饰差，所以在上述系统中的表达均不理想。

发明内容

为了解决背景技术中存在的问题，本发明的目的在于提供了一种家蚕表达重组蓖麻毒素蛋白A链的方法，以家蚕作为宿主生产重组蓖麻毒素蛋白A链，利用家蚕杆状病毒表达系统在家蚕内表达该毒素蛋白A链。具体是利用BmNPV构建含有蓖麻毒素蛋白A链基因的重组病毒，并利用家蚕作为宿主，表达生产重组蓖麻毒素蛋白A链，具有成本低、表达水平高的特点。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案其步骤如下：

(1)蓖麻毒素蛋白A链编码基因的克隆：以蓖麻籽抽提获得的总RNA为模板，利用RT-PCR系统一步克隆获得蓖麻毒素蛋白A链基因的PCR产物；

(2)含有蓖麻毒素蛋白A链基因的重组杆状病毒的构建：用限制性内切酶BamHI和HindIII消化PCR2.1-蓖麻毒素蛋白A链得到蓖麻毒素蛋白A链基因片段，然后将蓖麻毒素蛋白A链基因片段克隆入杆状病毒转移载体pBlueBacHisA获得重组体pBlueBacHisA-蓖麻毒素蛋白A链；通过共转染在家蚕培养细胞BmN内将重组体pBlueBacHisA-蓖麻毒素蛋白A链与家蚕核型多角体病毒(BmNPV)的基因同源重组产生重组病毒；

(3)家蚕体内表达重组蓖麻毒素蛋白A链：使用家蚕幼虫5龄起蚕，经口接种上述重组病毒进行感染表达，将涂布有病毒液的桑叶饲喂家蚕，然后在23-25℃下饲养；在饲养96小时后收集家蚕幼虫；从家蚕幼虫中收集血淋巴，用Ni-NTA亲和柱在非变性条件下进行蛋白纯化，获得最终的重组蓖麻毒素蛋白A链蛋白。