[发明专利]一种流式样品多波长荧光检测方法

说明书

一种流式样品多波长荧光检测方法，包括，使激光经过二向色镜进入物镜镜头后聚焦照射到样品池上；样品池中的荧光样品流经激光焦斑时发射多波长荧光，多波长荧光由聚焦物镜镜头收集后，依次穿过二向色镜、长通滤光片、光栅，在光学成像仪上形成一个零级光斑和若干个一级条纹；根据光学成像仪记录的荧光零级光斑和一级条纹，测量计算荧光样品的各发射光谱和浓度。本发明的方法，仅需一个光学检测器即可实现流式样品的多波长荧光检测，避免了以往使用多个光学检测器造成的仪器体积过大和灵敏度不够高的问题。

技术领域

本发明涉及生物化学分析与传感技术领域，具体涉及一种流式样品多波长荧光检测方法。

背景技术

荧光物质在受到光激发时，基态电子跃迁至激发态，当电子跃迁回基态时发光的现象称为荧光。荧光分析是一种非常重要而常用的生化分析和生物传感方法。在众多的仪器中广泛使用，比如分光光度计、荧光光谱仪、荧光显微镜、共聚焦显微镜、全内反射显微镜、双光子荧光光谱仪以及如流式细胞仪等。这些仪器大多只能对单一的荧光物质进行分析。对于发射多种波长的流式荧光样品的同时检测，通常利用多个不同波段的滤光片将多波长荧光分光，将不同波长的荧光引入不同的检测通道，每个检测通道需要一个检测器。这导致多波长荧光检测需要多个检测器，一方面增加了仪器成本，另一方面减弱了荧光信号、降低了检测灵敏度。

发明内容

本发明的目的是提供一种高灵敏度、低成本的流式样品多波长荧光检测方法。

为实现上述发明目的，本发明的技术方案具体如下：

一种流式样品多波长荧光检测方法，包括以下步骤：

S1：使激光经过二向色镜进入物镜镜头后聚焦照射到样品池上；

S2：样品池中的荧光样品流经激光焦斑时发射多波长荧光，多波长荧光由聚焦物镜镜头收集后，依次穿过二向色镜、长通滤光片、光栅，在光学成像仪上形成一个零级光斑和若干个一级条纹；

S3：根据光学成像仪记录的荧光零级光斑和一级条纹，测量计算荧光样品的各发射光谱和浓度。

进一步的，所述的样品为流动样品，所述样品池为样品流动池，样品流动池为毛细管或微通道，样品流动方向与激光照射方向垂直。

进一步的，所述样品流动池的横截面形状为圆形、方形、或梯形，所述样品流动池的材质为玻璃、石英或高聚物。

进一步的，所述样品流动池的横截面长度、宽度或直径在1微米～3毫米之间。

进一步的，多波长荧光样品是单一样品标记多波长荧光探针或混合样品分别标记不同波长的荧光探针。

进一步的，所述二向色镜和长通滤光片之间还具有反射镜和狭缝

进一步的，所述光栅为透射光栅或反射光栅，光栅常数为30～1000线/毫米。

进一步的，所述激光激发是单束激光激发或多束激光同时激发。

进一步的，所述光学成像仪为电感耦合器件或互补金属氧化物半导体传感器。

进一步的，所述步骤S3具体包括：根据光学成像仪记录的荧光零级光斑和一级条纹，通过分别测量零级光斑与各一级条纹的距离以及各一级条纹的强度分布测定荧光样品的多个发射光谱；通过测定对应一级条纹的强度测定荧光物质浓度。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

本发明的方法，以激光为激发光源，将流式多波长荧光样品在激光焦斑内激发，受激发射的多波长被光栅分光为零级光斑和多个一级条纹，在光学成像仪上成像记录；以一级条纹位置判定荧光波长以及种类，以一级条纹光谱强度与荧光物质浓度关系做曲线，然后对未知样品中的荧光物质进行定量；仅需一个光学检测器即可实现流式样品的多波长荧光检测，避免了以往使用多个光学检测器造成的仪器体积过大和灵敏度不够高的问题。