[发明专利]一种以四肽为功能配基的亲和仿生层析介质

说明书

本发明公开了一种以四肽为功能配基的亲和仿生层析介质，可用于抗体分离纯化，其四肽的氨基酸序列为苯丙氨酸—酪氨酸—色氨酸—精氨酸。采用烯丙基溴活化和溴代醇化，在多糖凝胶上连接空间臂己二胺，再偶联已乙酰化的苯丙氨酸—酪氨酸—色氨酸—精氨酸四肽配基，得到四肽层析介质。本发明的四肽层析介质，对抗体具有良好的吸附能力，且选择性高，可在弱碱性(pH 8.0)条件下吸附抗体，弱酸性(pH 5.0)条件下洗脱，分离条件温和，可用于从人血清中分离免疫球蛋白和细胞培养中分离单克隆抗体。

技术领域

本发明涉及一种以四肽为功能配基的亲和仿生层析介质，预计抗体分离纯化应用，属于生物化工领域中的蛋白层析分离技术。

背景技术

单克隆抗体(mAb)广泛应用于治疗癌症、自身免疫性疾病等。近年来，随着抗体工程发展，细胞表达水平显著提升，已高达10g/L。抗体药物纯度要求高，分离纯化工艺复杂，下游过程占生产成本的比重较大(50-80％)，研发经济高效的分离纯化新方法，已成为抗体制备领域的研究热点。

目前，最常用的抗体纯化技术为蛋白A亲和层析技术，其具有高选择性的优势。然而，蛋白A亲和介质价格昂贵，且存在配基易脱落、洗脱条件苛刻、配基脱落易引起免疫应答等不利因素。短肽仿生配基与蛋白配基相比，具有更加稳定、更小的免疫原性以及更廉价等优点，因此，得到抗体分离纯化领域的广泛关注。现今为止，已有诸多短肽配基被发现并成功应用于抗体分离纯化。Wang等(CN 104645949A；Biochemical EngineeringJournal.2016,114:191–201)设计和筛选得到四肽配基(酪氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-组氨酸)。此四肽介质可从含BSA的hIgG混合蛋白溶液中很好地分离纯化hIgG，此外，该四肽介质可很好地应用于CHO细胞中分离纯化单抗。但该配基需要通过添加盐离子屏蔽非特异性吸附，才能得到高纯度的抗体。Yao等(CN108905980A)利用分子模拟技术发明了一种以Ac-FYHE为功能配基的四肽层析介质。该介质可在中性条件下有效吸附抗体，且能在弱酸性条件下高效解离抗体，且可应用于从细胞培养上清液中分离单克隆抗体和人血清中分离hIgG。考虑酸性条件下分离纯化可能会引起蛋白的变性和聚集，故该四肽的分离条件需进一步优化。Menegatti等(Biotechnology and Bioengineering.2013,1175:249-258)通过mRNA展示和组合化学技术，设计出环状五肽配基库，筛选得到亲和性较强的环五肽[Link-M-WFRHY-K]。该环肽介质可很好地从工业CHO培养上清液中分离纯化IgG,而其分离条件偏酸性。考虑洗脱条件温和既能降低抗体变性的可能性，又能增加介质的稳定性，故而，再进一步实验中主要寻找性能更加优良的短肽配基，在提高吸附容量的同时使洗脱条件更为温和。

短肽亲和仿生介质主要由三部分组成，分别是基质、空间臂和短肽仿生配基。本发明设计四肽配基时，考虑常用的天然配基蛋白A和蛋白G中，起关键作用的残基包括苯丙氨酸，赖氨酸，色氨酸，组氨酸，精氨酸等(Journal of molecular recognition.2014,27:501-509)。为模拟天然配基的结构与功能，从文献报道关键氨基酸中任选四个随机组合，构成了四肽配基库。随后，通过计算机LibDock技术，计算配基库中四肽与Fc(PDB:1FC1)片段结合时的打分分数，筛选得到具有较高分数的四肽配基FYWR。之后研究中，将筛选得到的乙酰化的四肽配基(Ac-FYWR)接枝于以己二胺为空间臂的琼脂糖4FF上，制备得到四肽仿生介质，用于后续的分离纯化实验。

发明内容

本发明的目的是提供一种以氨基酸序列为苯丙氨酸—酪氨酸—色氨酸—精氨酸的四肽作为功能配基、多糖凝胶为基质、己二胺为空间臂的四肽亲和仿生层析介质，并应用于抗体分离纯化。

本发明首先提供了一种四肽亲和仿生层析介质，该介质包括层析基质、空间臂和配基，所述的层析基质为带有羟基的亲水性多糖凝胶，空间臂为己二胺，配基为氨基酸序列为苯丙氨酸—酪氨酸—色氨酸—精氨酸的四肽。

配基的分子结构为：