[发明专利]一种碱性磷酸酶活性即时检测方法

说明书

本发明公开了一种碱性磷酸酶活性即时检测方法。利用样本溶液中的碱性磷酸酶分析物在催化焦磷酸水解反应后，后续加入的Cu²⁺因未被焦磷酸络合而能够被Cu²⁺选择性检测电极高灵敏检测的机制。该电极响应信号的大小与样本溶液中碱性磷酸酶活性的大小呈正相关，即完成碱性磷酸酶活性的即时定量检测。本发明方法简单易行，未经专业培训的操作人员也能开展实验，且不使用任何酶标仪、荧光仪、电化学工作站等大型专业分析仪器进行定量信号读取，极大降低分析成本，具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明属于生化分析与生物传感技术领域，具体涉及一种碱性磷酸酶活性即时检测方法。

背景技术

碱性磷酸酶，也称碱性磷酸酯酶，可以在碱性条件下催化磷酸酯键的水解。哺乳动物中，肝脏、胆管、肾脏、骨头和胎盘中的碱性磷酸酶活性比较高。常见的碱性磷酸酶包括肠道碱性磷酸酶、非组织特异性碱性磷酸酶和胎盘碱性磷酸酶。碱性磷酸酶活性过高或过低与多种疾病相关。例如，分化的结肠癌细胞中碱性磷酸酶的活性会显著升高，被当作结肠癌细胞分化程度定性和定量的指标。血清中碱性磷酸酯酶的升高，被称作高碱性磷酸酶血症，被认为和恶性胆管阻塞、原发性胆管硬化、原发性硬化胆管炎、肝淋巴瘤和肝肉瘤等肝胆疾病密切相关。血清中碱性磷酸酶活性过低也和一些疾病相关。因此，生物样本中碱性磷酸酶活性的定量检测具有十分重要的医学意义。目前现有的碱性磷酸酶活性检测方法主要借助酶标仪、荧光仪、电化学工作站等分析仪器实现定量检测。然而，这些方法对操作人员要求较高的专业技能，特别是所使用的仪器价格较为昂贵且体积庞大，导致整体分析成本较高，也不能实现现场分析和即时检测（Point-of-Care Testing）。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种碱性磷酸酶活性即时检测方法。

本发明的思路：在溶液中进行各种化学与生物反应，并利用廉价的离子选择性检测电极进行定量信号读取。溶液中进行的化学与生物反应包括碱性磷酸酶特异性催化焦磷酸水解反应以及剩余的焦磷酸特异络合二价铜离子（Cu²⁺）反应。进而利用廉价的Cu²⁺选择性检测电极高灵敏检测未被焦磷酸络合的游离Cu²⁺。检测电极的响应信号正比于游离Cu²⁺的数量，而后者正比于样本中碱性磷酸酶的活性大小。换言之，通过选择性检测电极简单量测最终反应溶液中游离Cu²⁺的浓度大小即可进行碱性磷酸酶活性的定量检测。因此，通过使用价格极低的选择性检测电极代替酶标仪、荧光仪、电化学工作站等大型昂贵的分析仪器，可显著降低分析成本。若使用电池供电的笔式电极还可实现碱性磷酸酶活性的现场分析和即时检测。

具体步骤为：

步骤一，将碱性磷酸酶样本溶液与焦磷酸溶液混合反应，焦磷酸分子被碱性磷酸酶特异性水解为磷酸根离子。

步骤二，然后往步骤一所得混合溶液中加入Cu²⁺溶液，进行Cu²⁺-焦磷酸络合反应。

步骤三，再利用离子检测电极测定步骤二所得混合溶液中未被络合的游离Cu²⁺的浓度，所得电极响应信号大小与碱性磷酸酶样本溶液中碱性磷酸酶活性的大小呈正相关，即完成碱性磷酸酶活性的即时定量检测。

所述步骤一中的水解反应通过简单的溶液混合操作来完成，未被碱性磷酸酶水解的焦磷酸能够特异性络合后续加入的Cu²⁺。

所述步骤二中的络合反应通过简单的溶液混合操作来完成，未被焦磷酸特异性络合的游离Cu²⁺能够被离子检测电极定量检测，而离子检测电极对焦磷酸-Cu²⁺络合物中的Cu²⁺不产生响应信号。