[发明专利]一种基于双酶-无机纳米花复合材料的酒精定量分析方法

说明书

本发明公开了一种基于双酶‑无机纳米花复合材料的酒精定量分析方法。所述方法包括将醇氧化酶(AOX)、辣根过氧化物酶(HRP)、CaCl₂溶液加入磷酸盐缓冲溶液中，室温静置反应，得到双酶‑无机纳米花复合材料(AOHNF)。反应条件简单，得到的材料酶活性和稳定性均显著增强。再利用AOX催化氧化溶液中酒精发生反应生成H₂O₂，HRP催化TMB与H₂O₂反应使溶液呈现蓝色，测定吸收波长在650nm处的吸光度，从而得出溶液中酒精浓度的大小。分析方法操作简单，检测结果灵敏度高。本发明所述的基于双酶‑无机纳米花复合材料的酒精定量分析方法具有操作简单、灵敏度高、稳定性好等特点，发展前景良好。

技术领域

本发明属于定量分析领域，具体涉及一种基于双酶-无机纳米花复合材料的酒精定量分析方法。

背景技术

随着时代的发展，高灵敏度、高选择性和高准确度的醇类化合物的检测在许多不同的领域应用广泛，快速、灵敏、选择和定量地检测醇类物质对于执法、化工、制药和发酵等行业也具有重要意义，其中精确和快速测定乙醇含量在临床和法医分析中非常重要。此外，简单、快速和经济的酒精分析方法也在纸浆、食品和饮料行业中被用来控制发酵过程及其产品的质量。在交通执法、法医、临床分析等过程中，常用的酒精检测技术为呼气检测法、唾液检测法、尿液血液检测法。呼气法是一种非侵入式、便捷且快速诊断的方法，一般使用呼气式酒精检测仪来进行测定，通常口气中的酒精含量不稳定，易受被测者呼气量、口腔残留有未吸收酒精等的影响，造成测定结果出现错误；唾液法则主要是使用酶试纸条进行测定，这种方法快速、便宜且易操作，一般在急诊科室中较常应用；尿液检测法是指通过提取当事人的尿液进行尿液酒精浓度检测，血液检测法主要是提取血液中的乙醇来检测其含量，通常在处理一些事故并将其作为依据时使用这种方法。利用酶法进行血、尿酒精浓度的检测具有很好的精准性、重复性和特异性，但无法现场检测，只能交由专业机构室内测试，若送检不及时会出现较大的误差。

近年来，已经报道了很多用于酒精测定的方法，如比色法、色谱法、氧化还原滴定法、折射率法等，其中比色法和色谱法是应用相对较多的方法。传统比色法主要是使用重铬酸钾进行测定，但其有一个缺点是不符合“比尔定律”，其中的一种氧化产物铬离子为绿色，它以不同的浓度与正在测量的黄色重铬酸根离子混合，使比色结果出现误差，导致测定结果失去稳定性。色谱法用于血液或体液中酒精的检测，现常用顶空采样和直接样品注射两项技术来代替以前的溶剂提取或蒸馏的方法，自动化高，测定结果稳定可靠，但该方法的测定过程较复杂，容易对注射口、柱子等造成污染，且耗费时间较长，无法满足对酒精进行快速定量测定的要求。为了克服这些缺点，出现了基于NAD⁺依赖性醇脱氢酶或醇氧化酶的各种醇生物传感器对酒精进行分析测试，这些方法主要是利用生物酶对醇类物质的催化活性，目前也已成功的运用在监控刑事司法中的酒精犯罪者、医疗监护以及发酵过程中酒精的测定。这类传感器具有高选择性，但是其相关的使用费用很高，且无法充分解决酒精检测的缺点，例如低灵敏度、低稳定性和在实际应用中的狭窄的线性操作范围。生物酶稳定性低，不容易长期保存，易失活，这给以上通过生物酶来进行酒精检测的方法带来了一定的局限性。

酶作为多功能工具，由于其独特的性质，如高反应特异性、高催化活性和低毒性而被广泛研究，但天然游离酶存在一些固有的缺点，如制备和纯化成本高、操作稳定性低、催化活性对环境条件敏感以及难以回收。为了克服这些缺点，已经报道提出了将酶固定化的概念，将酶嵌入纳米材料成为近年来研究的热点。研究表明，固定在纳米材料上的酶具有比天然酶更宽的pH和温度适应范围以及更高的热稳定性的特点。由于三维结构的纳米材料在表面积、反应活性、稳定性等方面优于其他纳米材料，因此三维纳米材料成为近年来研究酶固定的热点。

发明内容