[发明专利]一种轴向超分辨的双光子荧光显微装置及方法

权利要求书

1.一种轴向超分辨的双光子荧光显微装置，包括激发光路和探测光路，所述探测光路上设有用于聚焦荧光的场镜和将探测到的光信号转换成为电信号并传至计算机的探测器；其特征在于，所述激发光路上沿光路依次布置有：

飞秒激光器，用于发出超短脉冲激光对荧光样品进行双光子激发；

第一半波片，用于调节设于所述飞秒激光器之后的光参量振荡器出射光的s光和p光的比例；

偏振分束器，与所述第一半波片配合，调节光路中的光强；

起偏器，使p偏振光入射到空间光调制器；

空间光调制器，用于将光斑调制成轴向空心光斑；

第二半波片，用于将线偏振光转换为圆偏振光，其后设有扫描系统和二色镜，激发光透过所述二色镜进入显微物镜，照明荧光样品，所述荧光样品产生的荧光经二色镜后反射进入所述探测光路；

所述计算机用于处理探测器传送过来的电信号，并控制振镜系统对样品进行x和y方向上的扫描以及控制显微物镜轴向移动进行z方向上的扫描。

2.根据权利要求1所述的双光子荧光显微装置，其特征在于，所述的第二半波片之后的光路上设有四分之一波片，用于补偿后续元件造成的圆偏振光的偏振变化。

3.根据权利要求1所述的双光子荧光显微装置，其特征在于，所述的空间光调制器对激发光斑进行0～π相位调制。

4.根据权利要求1所述的双光子荧光显微装置，其特征在于，所述的荧光样品放置在固定的载物台上。

5.根据权利要求1所述的双光子荧光显微装置，其特征在于，所述的探测器为光电倍增管。

6.根据权利要求1所述的双光子荧光显微装置，其特征在于，所述的振镜系统包括分别用于x方向与y方向上扫描的两片扫描振镜。

7.一种轴向超分辨的双光子荧光显微方法，基于权利要求1～4中任一权利要求所述的双光子荧光显微装置实现，其特征在于，包括以下步骤：

1)飞秒激光器发出激发光束，经过光参量振荡器出射，并经过第一半波片和偏振分束镜后得到的线偏振光；

2)线偏振光束进入起偏器，保证入射到空间光调制器的光束为p偏振光；

3)空间光调制器对入射光进行0～π相位调制，得到双光子轴向空心激发光斑；

4)依次用实心光斑和轴向空心光斑扫描同一样品同一区域分别得到实心光斑扫描图像和轴向空心光斑扫描图像，利用荧光差分方法，选择差分系数，得到轴向超分辨显微图像。