[发明专利]一种双光子荧光成像方法、系统及图像处理设备

说明书

本发明适用于双光子荧光技术领域，提供一种双光子荧光成像方法、系统及图像处理设备，通过依次对入射的两个脉冲光束进行波前整形，得到在物镜的焦点处的光场为梯度光场的两个光束，并使两个光束的梯度光场的光强分布相反，然后依次通过两个光束对待测样品进行扫描得到两幅图像，并根据两幅图像进行三维数据重建，得到待测样品的三维深度图像，成像速度快、分辨率高且算法简单，易于实现，并且由于成像速度快，有效降低了对待测样品的光损伤和光漂白作用，尤其适用于对胚胎发育样品和神经活动样品进行三维成像。

技术领域

本发明属于双光子荧光技术领域，尤其涉及一种双光子荧光成像方法、系统及图像处理设备。

背景技术

现有的双光子荧光显微镜主要通过非线性效应只在能量最高的焦点处激发荧光信号，提供光学切片能力，一次只能对样品的某一深度位置进行成像。要实现对样品的大体积三维区域成像，通常采用以下三种技术实现：

技术一、借助步进电机或者变焦透镜使焦点可以沿样品的深度方向轴向移动，这种方式成像速度较慢；

技术二、利用贝塞尔光束的焦点轴向拉长的特点实现对样品的大体积三维区域的扫描，这种方式缺乏轴向的位置信息；

技术三、将两个入射光束的焦点设计成V型，使同一个荧光信号在图像中有两个对应的位置，这两个对应的位置的间距和荧光信号的轴向位置有关，从而可以将荧光信号的轴向位置信息转化为两个对应的位置的横向位置信息，实现三维成像，这种方式为了实现V型的焦点，每一个入射光束只用了不到1/4的数值孔径，分辨率很差，还需要使用复杂的算法来进行位置配对。

发明内容

有鉴于此，本发明实施例提供了一种双光子荧光成像方法、系统及图像处理设备，以解决对样品进行大体积三维区域成像的现有技术成像速度慢、分辨率差、算法复杂的问题。

本发明实施例的第一方面提供了一种双光子荧光成像方法，应用于双光子荧光成像系统，所述双光子荧光成像方法包括：

对入射的第一脉冲光束进行波前整形，得到第一光束；其中，所述第一光束在所述双光子荧光成像系统的物镜的焦点处的光场为第一梯度光场，所述第一梯度光场的光强分布沿z轴呈梯度变化，z轴方向为待测样品的深度方向；

通过所述第一光束扫描待测样品，得到第一图像；

对入射的第二脉冲光束进行波前整形，得到第二光束；其中，所述第二光束在所述物镜的焦点处的光场为与所述第一梯度光场的光强分布相反的第二梯度光场；

通过所述第二光束扫描待测样品，得到第二图像；

根据所述第一图像和所述第二图像进行三维数据重建，得到所述待测样品的三维深度图像。

在一个实施例中，对入射的第一脉冲光束进行波前整形，得到第一光束，包括：

对入射的第一脉冲光束的偏振方向进行旋转，得到预设偏振方向的第一偏振光束；

对所述第一偏振光束进行空间相位调制，得到第一预设相位的第一光束；

对入射的第二脉冲光束进行波前整形，得到第二光束，包括：

对入射的第二脉冲光束的偏振方向进行旋转，得到预设偏振方向的第二偏振光束；

对所述第二偏振光束进行空间相位调制，得到第二预设相位的第二光束。

在一个实施例中，对入射的第一脉冲光束进行波前整形，得到第一光束之前，包括：

设计光强沿z轴分布的第一焦点；其中，所述第一焦点处的光场为第一梯度光场；

设计光强沿z轴分布的第二焦点；其中，所述第二焦点处的光场为第二梯度光场；