[发明专利]一种稀有肿瘤细胞富集方法及试剂盒

说明书

本发明公开了一种稀有肿瘤细胞的富集方法，包括如下步骤，用粘附剂包被细胞分离载体，将待富集的样品加入包被后的载体中，将加样后的多孔培养板进行富集处理，吸附于底部粘附剂包被层的为稀有肿瘤细胞。本发明利用包被的粘附剂层形成粘性界面，而且肿瘤细胞表面粘附性蛋白的表达量较白细胞高，粘附能力较白细胞更强，在同等条件下，肿瘤细胞先被粘附，白细胞未粘附而被去除，从而达到富集目的。本发明还公开了用于富集循环肿瘤细胞的试剂盒。本发明所述的富集方法操作简单，富集效果好，白细胞去除率和肿瘤细胞回收率高，有良好的应用前景。

技术领域

本发明属于生物医学领域，具体涉及一种稀有肿瘤细胞富集方法、富集用试剂盒以及牛血清白蛋白在制备该试剂盒中的应用。

背景技术

恶性肿瘤在播散、侵袭、转移的过程中常伴有肿瘤细胞进入体液，如血液、胸水、腹水、脑脊液等。因此，在此类样本中对肿瘤细胞进行检测是判定肿瘤存在、转移的关键，具有重要的临床意义。例如，循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs)主要指为自发或因诊疗操作脱离实体瘤原发灶或转移灶而进入外周血循环的肿瘤细胞。透过基底膜进入血液后，少数CTCs能逃避机体的免疫杀伤而存活下来，部分肿瘤细胞团也可以直接从原发灶脱离并进入循环系统，形成循环肿瘤微栓。

血中的CTCs不仅具有循环的特性，还保留了原始肿瘤细胞的生物学特性，包括细胞体积、表面蛋白及糖蛋白、电荷等特性。这些CTCs和CTM随血液播散后可在其他部位形成新的转移灶，与肿瘤的转移和复发密切相关。因而CTCs的检测及分析在微转移灶早期发现、疗效评估与个体化治疗等方面具有重要临床应用价值。但是，这类样本中的肿瘤细胞通常数量非常稀少，例如CTCs在外周血中十分稀少，大约为每10¹⁰(100亿)个血细胞或每10^8-9个白细胞中存在1个CTC。

因此，稀有肿瘤细胞的富集是一切研究工作的基础，目前，如何从恶性肿瘤患者体液样本中分离稀有肿瘤细胞，从而中得到更多的诊断信息和治疗信息是生物医学领域面临的共同挑战。

现有的稀有肿瘤细胞富集方法主要有以下几种：

a)基于生物学特性-蛋白表达：包括正向富集(使用表面蛋白抗体结合稀有肿瘤细胞，如Epcam抗体)，或者负向富集(CD45抗体结合白细胞等非稀有肿瘤细胞，再利用磁珠去除白细胞，达到富集目的)。

b)基于物理特性-大小、电荷：包括膜过滤、芯片过滤、密度梯度离心、介电电泳等。膜过滤和芯片过滤是指利用肿瘤细胞比白细胞体积大，使用带固定孔隙的膜或芯片进行过滤，得到体积较大的细胞；密度梯度离心是使用固定的密度分离液，将肿瘤细胞与其他单个核细胞进行分离，去除了除单个核细胞以外的红细胞及白细胞；介电电泳法是基于细胞的介电性质例如膜容量、膜阻抗和胞质电导率是随细胞结构和活动而变化，不同细胞有不同的介电性质，经测定证明肿瘤细胞的电容远大于各种血细胞，因此可通过介电性质的不同将肿瘤细胞与其他各种血细胞进行分离。

c)基于物理特性结合生物学特性：例如droplet微滴芯片、微流控。

但是，上述方法中，基于抗原抗体结合从而进行富集的方法如细胞表面蛋白EpCAM等这类标志物富集稀有肿瘤细胞的特异性欠佳，部分正常内皮细胞也会表达上皮型标志物，甚至有研究表明极少数中性粒细胞也会表达；而且，这类标志物只表达在部分上皮源性的恶性肿瘤(癌)中，无法用于间叶组织源性的恶性肿瘤，并且即使是源自上皮组织的恶性肿瘤，研究也证实肿瘤细胞亦会在转移、进展和治疗等情况下发生EMT而导致该类标志物的表达降低甚至缺失，从而导致漏检。此外也有文献报道，循环肿瘤细胞在与抗体结合后改变其原有的信号通路；采用类似的方法，通过耗尽CD45阳性白细胞来富集稀有肿瘤细胞，但相当一部分白细胞只有低水平的表面标志物表达，导致富集的效率欠佳。